Tıkanma sarılıklı ratlarda taurolidine'in kolonik anastomoz iyileşmesi üzerine etkisi

Özet

Amaç: Tıkanma sarılığı oluşturulmuş ratlarda Taurolidine kullanımının barsak anastomozu ve dolayısıyla yara iyileşmesi üzerine etkisini araştırmak.

Yöntem: Çalışmada 40 adet erkek Wistar-albino cinsi sıçan kullanıldı. Ratlar çalışma öncesinde 12 saat aç bırakıldı ve TNF-α için kan örneği alındı . Yirmi rat içeren 2 ana grup oluşturuldu. Bunlar sham grubu ve koledokları bağlanarak kesilip tıkanma ikteri oluşturulan gruptu. Tüm ratlara, birinci cerrahi girişimden 4 gün sonra inen kolon tam kat kesisi ve anastomoz uygulandı. Tıkanma sarılığı ve kontrol grupları kendi içerisinde iki alt gruba ayrıldı. 1.günden itibaren deneklerin yarısına intraperitoneal 200mg/kg/gün serum fizyolojik (SF), diğer yarısına aynı dozda Taurolidine verildi. Anastomozdan 7 gün sonra denekler sakrifiye edildi. Anastomoze segment dışarı alınıp patlama basıncı ölçüldü. Bu segmentten hidroksiprolin ve histolojik inceleme için numune alındı. TNF-α ve bilirubin için kan örneği alındı.

Bulgular: Tıkanma sarılığı-SF (TS-SF) grubunda ortalama anastomoz patlama basıncı, tıkanma sarılığı-Taurolidine (TS-T) grubu ile tıkanma sarılığı olmaksızın SF verilen gruba göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde düşük bulunmuştur (p<0.01). TS-T ve tıkanma sarılığı olmayan gruplar arasında ortalama patlama basıncı açısından anlamlı fark saptanmamıştır (p>0.05). TS-SF grubunun anastomozunda ortalama doku hidroksiprolin konsantrasyonu, TS-T grubu ile tıkanma sarılığı olmaksızın SF verilen gruba göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde düşük bulunmuştur (p<0.001). TS-SF grubunun anastomoz iyileşmesindeki ortalama TNF-α konsantrasyonu TS-T grubu ile tıkanma sarılığı olmaksızın SF verilen gruba göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde yüksek saptanmıştır (p<0.001). Taurolidine verilen tıkanma sarılığı olan ve olmayan gruplar karşılaştırıldıklarında TNF-α konsantrasyonu açısından anlamlı fark saptanmamıştır. Tıkanma sarılığı olmayıp, Taurolidine ve SF'in verildiği gruplar karşılaştırıldığında, istatiksel açıdan anlamlı fark saptanmamıştır. Histopatolojik incelemede, TS-T grubunda deneklerin anastomoz kesitlerinde, TS-SF grubuna göre, ödemin ve tüm katlardaki inflamatuar hücre infiltrasyonunun azaldığı, fibroblastik aktiviteye eşlik eden yeni kollajen sentezinin daha fazla olduğu ve belirgin yeni damar oluşumu gözlendi.

Sonuç: İntraperitoneal uygulanan Taurolidine'in, yüksek TNF-α düzeylerini düşürdüğü ve uygulanan kolonik anastomozda patlama basıncı ve hidroksiprolin konsantrasyonunu pozitif yönde etkilediği görülmüştür.

Anahtar Kelimeler: Taurolidine, tıkanma sarılığı, kolonik anastomoz iyileşmesi

Giriş

İlerlemiş preoperatif tetkik imkânları ve daha iyi postoperatif bakım şartlarına rağmen, tıkanma sarılığı olan hastalarda enfeksiyon, böbrek yetmezliği, koagülopati, respiratuar yetmezlik, yara iyileşmesinin önemli derecede gecikmesiyle birlikte yara açılması, herni oluşumu ve anastomoz sızdırması gibi [1] cerrahi mortalite ve morbiditeyi arttıran komplikasyonların insidansı hala yüksektir [2,3]. Safra tuzları ve yüksek hücre içi bilirubin düzeylerinin sitotoksisitesi, immun defans mekanizmalarında bozukluk barsak florası ve mukoza bütünlüğündeki bozulmalar [4], bakteriyel translokasyon, artmış mukozal permeabilite [5,6,7] ve Kupffer hücrelerinin endotoksin temizlemesindeki azalma tıkanma sarılıklı hastalarda görülen patofizyolojik olaylardır. Tıkanma sarılığının sistemik etkilerinin patogenezinde çoğunlukla kabul edilmiş anahtar olay sistemik endotoksemidir [8]. Endotoksemi sonucunda ortaya çıkan sitokinlerden özellikle TNF-α'nın aşırı sekresyonunun proinflamatuar sitokin şelalesini körükleyebileceği ve tıkanma sarılığındaki önemli komplikasyonlardan sorumlu olabileceği düşünülmektedir [9]. Yara iyileşme bölgesinde yüksek TNF-α konsantrasyonları iyileşme sürecindeki fizyolojik rolünü gösterir ve TNF-α'nın yara iyileşmesi aşamalarında, kollajen sentezine down-regülasyon şeklinde etki ettiği rapor edilmiştir [10]. TNF-α'nın, fibroblastlardan kollajenaz enziminin salınımını arttırarak da, ölçülebilen kollajen miktarını azalttığı bildirilmiştir [11]. Yara iyileşmesi basamaklarından birinin inflamasyon fazı olduğu düşünüldüğünde, TNF-α düzeyindeki değişikliklerin yara iyileşmesindeki dengeleri bozabileceği akla gelmektedir.

Taurolidine, anti-endotoksin özellikleri olan bir farmakolojik ajandır [12] ve direkt olarak hücre zarındaki kimyasal reaksiyonlar yolu ile etki eder. Taurolidine'in metaboliti ve aynı zamanda endojen bir aminoasit olan Taurine, reaktif oksijen partiküllerinden hipoklorik asid (HOCL) ile birleşerek daha az aktif metaboliti olan N-klorotaurine meydana gelir. Bu metabolit bakterisidal etkili olup, aktive makrofajlardan TNF-α ve nitrik oksit (NO) sentezini baskıladığı gösterilmiştir [13].

Tıkanma sarılığının radikal veya palyatif cerrahi girişimlerle düzeltildiği hallerde barsak anastomozları sıkça başvurulan yöntemlerdendir. Barsak anastomozu iyileşmesinin aslında bir yara iyileşmesi olduğu düşünülürse, tıkanma sarılığında yara iyileşmesinde görülen olumsuzlukların barsak anastomozu iyileşmesinde de görülmesi kaçınılmazdır.

Biz bu deneysel çalışmada, yukarıda söz ettiğimiz bilgilerin ışığında tıkanma sarılığı oluşturulmuş ratlarda Taurolidine kullanımının barsak anastomozu iyileşmesi üzerine etkisini araştırmayı amaçladık.

Gereç ve Yöntemler

Çalışma, Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandı ve aynı üniversitenin Cerrahi Bilimler Araştırma Laboratuarı'nda gerçekleştirildi. Çalışmada ortanca ağırlıkları 234 gr olan (202 gr-330gr) 40 adet erkek Wistar-albino cinsi sıçan kullanıldı. Denekler çalışma süresince standart şartlarda korunup (20-24 °C oda sıcaklığı, %50-60 nem oranı), standart yem ve su ile beslendi. Tüm ratlar cerrahi girişimden 12 saat önce aç bırakıldı. Anestezi için 30-50mg/kg dozunda intraperitoneal ketamin-HCL (Ketalar-Parke Davis) kullanıldı ve cerrahi girişimler steril koşullarda gerçekleştirildi. Çalışma öncesinde tüm ratlardan TNF-α için kan örneği alındı. Her biri 20 rat içeren 2 ana grup oluşturuldu: Lee metoduna (54) uygun olarak koledoğun bağlanıp kesilerek tıkanma sarılığı oluşturulan deney grubu (tıkanma sarılığı grubu, TS) ve sham ameliyatı yapılan sarılıksız deney grubu (kontrol grubu, K). Tüm ratlara, birinci cerrahi girişimden (tıkanma sarılığı grubunda ana safra kanalı bağlanması, kontrol grubunda sham ameliyatı) 4 gün sonra inen kolon tam kat kesisi ve anastomoz uygulandı. Anastomozdan 7 gün sonra denekler sakrifiye edildi. Anastomoze segment dışarı alınıp patlama basıncı ölçüldü. Bu segmentten hidroksiprolin ve histolojik inceleme için numune alındı. TNF-α ve bilirubin için kan örneği alındı. Tıkanma sarılığı ve kontrol grupları kendi içerisinde iki alt gruba ayrıldı. 1. günden itibaren bir yarısına intraperitoneal 200 mg/kg/gün serum fizyolojik (SF), diğer yarısına aynı dozda Taurolidine verildi. Buna göre gruplar şu şekilde oluştu:

1. grup (TS): Ana safra kanalı bağlanarak tıkanma sarılığı oluşturulan, 1. günden itibaren intraperitoneal 200 mg/kg SF verilen ve 4 gün sonra da inen kolon tam kat kesisi ve anastomozu uygulanan grup (n=10).

2. grup (TS-Taurolidine): Ana safra kanalı bağlanarak tıkanma sarılığı oluşturulan, 1. günden itibaren intraperitoneal 200 mg/kg Taurolidine verilen ve 4 gün sonra da inen kolon tam kat kesisi ve anastomozu uygulanan grup (n=10).

3. grup (K): Sham ameliyatı yapılan, 1. günden itibaren intraperitoneal 200 mg/kg SF verilen, bu cerrahi girişimden 4 gün sonra da inen kolon tam kat kesisi ve anastomozu uygulanan kontrol grubu (n=10).

4. grup (K-Taurolidine): Sham ameliyatı yapılan, 1. günden itibaren intraperitoneal 200 mg/kg Taurolidine verilen ve bu cerrahi girişimden 4 gün sonra da inen kolon tam kat kesisi ve anastomozu uygulanan kontrol grubu (n=10).

Kolon anastomozu için kolona, peritoneal refleksiyonun 3 cm proximalindeki segmente keskin diseksiyonla tam tabaka kesi yapıldı. Anastomoz 5/0 prolen dikiş materyali kullanılarak ve tek kat olacak şekilde yapıldı.

Bu ratların hepsi anastomozdan sonraki 7. günde sakrifiye edildi.

Patlama Basıncı Ölçümü

İnen kolon tam kat kesisi ve anastomozu yapılan deneklerde anastomoz hattı ortada kalacak şekilde dört cm uzunluğunda kolon segmenti, zedelememeye dikkat edilerek, rezeke edildi. Barsak lümeni serum fizyolojik ile yıkanarak temizlendi.

Patlama basıncı ölçümünde volümetrik infüzyon pompası, civalı manometre ve metilen mavisi ile boyanmış serum fizyolojik kullanıldı.

Barsağın bir ucu anastomozun 1. 5 cm proximalinden 3/0 ipekle (Mersilk, Ethicon, USA) cıvalı manometreden gelen plastik tüpe, diğer ucu ise volümetrik infüzyon pompasından (Flogard R 6301, Baxter) gelen plastik tüpe bağlandı. Plastik tüpler arasında bağlı olan kolon segmenti; serum fizyolojikle doldurulmuş behere konuldu. Sistemdeki hava alındıktan sonra volümetrik infüzyon pompası ile barsak lümenine 2. 5 ml/dk hızıyla metilen mavili SF verildi. Bu esnada cıvalı manometredeki yükselme takip edildi. Beherdeki serum fizyolojiğin metilen mavisi ile lekelendiği an patlama basıncı olarak kabul edildi.

Patlama basıncı ölçüldükten sonra kolon segmentleri serum fizyolojik ile yıkandı ve lümenleri longitudinal olarak açıldı. Hidroksiprolin ölçümü için standardizasyon açısından 2. 2 ± 0. 5 mg olacak şekilde örnek alınarak -70°C'de donduruldu. Histopatolojik inceleme için de örnek alındı.

Biyokimyasal Tetkikler

TNF-α

Rat serumlarında TNF-α düzeyi, ticari rat TNF-α ELİSA kiti (Cytoscreen Immunoassay Kit, Katolog no: KRC 3012, Biosource International Camarillo, CA) kullanılarak ölçüldü. Bunun için, ratlardan alınan kanların santrifüjü ile ayrıştırılan ve –70°C'de, derin dondurucuda saklanan serumlar ve +4°C'de, buzdolabında saklanan ticari rat TNF-α ELİSA kiti oda ısısına çıkarılmış ve çözünmeleri sağlanmıştır. Kit içinde bulunan mikroplağın ilk sıra çukurları boş kontrol (blank) olarak alınıp, sadece 50 μl örnek diluenti, sonraki çukur dizilerine ise 50'şer mikrolitre (μl) standart solüsyon (sırasıyla 1000, 500, 250, 125, 62. 5, 31. 2, 15. 6 pg/ml olacak şekilde) ve 25'şer μl serum konmuştur. Boş kontrol çukurları dışındaki tüm çukurlara 50 μl Biotin konjugat solüsyonu (biotinlenmiş anti-TNF-α) konmasını takiben, buharlaşmasının engellenmesi için mikroplak özel kâğıtla kaplanarak, oda ısısında 90 dakika inkübasyona alınmıştır. Bu süre sonunda mikroplakta bulunan tüm çukurlar, kit içinde bulunan konsantre yıkama solüsyonu 25 defa dilue edildikten sonra, otomatik yıkayıcı ile beşer defa yıkanmıştır. Sonra, boş kontrol çukurları dışındaki tüm çukurlara 100 μl Streptovidin-HRP solüsyonundan eklenmiş, yeniden özel kâğıtla kaplanarak 45 dakika inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda çukurlar otomatik yıkayıcı ile beşer defa yıkanarak, boş kontrol çukurları dahil olmak şartıyla, tüm çukurlara 100 μl stabilize renklendirici eklenip oda ısısında ve karanlıkta 30 dakika beklenmeye alınmıştır. 30 dakika süre sonunda her bir çukura 100 μl reaksiyon durdurucu solüsyon (4 N sülfirik asit) ilave edilmiştir. Elde edilen karışımlarda, 450 nm filtre kullanılarak, ELISA okuyucusu (LP 400-Sanofi Pasteur) ile TNF-α ölçümleri yapılmıştır. Sonuçlar pg/ml cinsinden elde edilmiştir. Çalışmamızda kullandığımız kit 4 pg/ml'nin altındaki değerleri ölçebilmiştir.

Bilirubin

Serum total bilirubin düzeyi Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Ana Bilim Dalı'nda hazırlanan kit kullanılarak (kit içerisinde kullanılan maddeler, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deutschland'dan temin edilmiştir) Jendrassik-Graf metoduyla (referans aralığı:0. 2-1. 6mg/dl) enzimatik- kolorimetrik olarak çalışılmıştır (Technicon DAX-48 RandomAccess Autoanalyzer).

Anastomoz Hattında Yapılan

Hidroksiprolin

Barsak dokuları tartılıp, üzerlerine 2 ml 6 N HCl ilave edilip dijesyon fırınında hidroliz edildi. Hidrolizatlardan 25 μl alınan örnekler, liyofilize edilip, 1. 2 ml %50'lik (v/v) izopropil alkolde çözüldüler. Bu örneklere Kloramin-T solüsyonu eklenip 10 dakika beklenildi. Daha sonra 1'er ml. Ehrlich reaktifi eklenip 50°C'da 90 dakika inkübe edildi. Oluşan renk 560 nm dalga boyunda spektrofotometrede okundu. Aynı şartlar altında 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8, 1. 2 ve 1. 6 μg hidroksiprolin standartları da çalışıldı. Standart eğriden numune konsantrasyonları hesaplandı. Sonuçlar μg hidroksiprolin/mg doku olarak verildi [14].

%10'luk formaldehid içerisinde fikse edilen ve tüm anastomoz hattını içeren segment parafine gömüldükten sonra 5 mikronluk seri kesitler alındı Hematoksilen-eozin ve erken kollajen içeriği tespiti için Masson Trikrom boyası ile boyandı ve Greenhalg'ın [15] tariflediği yöntemle yara iyileşmesi skoru belirlendi. Her bir anastomoz kesitindeki inflamatuar hücre ve nötrofil infiltrasyonu, neovaskülarizasyon, fibroblastik aktivite ve kollajen bandı miktarı belirlendi. İstatistiki açıdan karşılaştırmak için 1:çok kötü, 2:kötü, 3:orta, 4:iyi ve 5:çok iyi yara iyileşmesi skoru olarak kabul edildi.

İstatistikler

Ölçümle elde edilen, sürekli verilerin (hidroksiprolin, total bilirubin,direkt bilirubin, TNF-α) normal dağılıma uygunluğu Shapiro-Wilk testi ile değerlendirildi. Bütün veriler normal dağılıma uyduğu için gruplar arası karşılaştırmalarda varyans analizi ve post hoc Tukey HSD (honestly significant difference) testleri kullanıldı. Anlamlılık düzeyi p<0. 05 olarak kabul edildi.

Anastomoz iyileşme skorları ordinal veri olduğu için değerlendirmede Kruskal Wallis varyans analizi ve takiben Bonferroni düzeltmeli Mann Whitney U testi kullanıldı. Bonferroni düzeltmeli Mann Whitney U testinde anlamlılık düzeyi p<0. 016 olarak kabul edildi.

Veriler sürekli değişkenlerde ortalama ±SS (standart sapma), ordinal değişkende ise ortanca (minimum-maksimum) olarak sunuldu.

Bulgular

Tıkanma sarılığı oluşturulan gruplarda, koledoğun bağlanmasını takip eden 48. saatte ratların idrar renkleri koyulaştı, 4. günde ise kuyruk ve kulaklarında daha belirgin olmak kaydıyla sarılık görünümü yerleşti. Sarılık, bu klinik belirtilerin yanısıra, 7. günde serum direkt bilirubin düzeylerinin sırasıyla grup 1 ve 2'de 7. 26 ± 1. 57 mg/dl ve 9. 08 ± 2. 21 mg/dl değerlerine ulaşmasıyla ve fizyolojik koşullarda 1 mm altında olan koledok çapının bağlamayı takip eden 4. günde (inen kolon anastomozu sırasında), bağlamanın proksimalinde kalan kısmının 3-4 mm çapa ulaşmasıyla doğrulandı.

Kontrol grubu olan grup 3 ve 4'de serum direkt bilirubin değerleri 0. 12 ± 0. 05 mg/dl ve 0. 10 ± 0. 05 mg/dl olarak saptandı.

SF verilen tıkanma sarılığı grubunun anastomoz iyileşmesinin 7. günündeki ortalama patlama basıncı, Taurolidine verilen tıkanma sarılığı grubu ile tıkanma sarılığı olmaksızın SF verilen gruba göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde düşük bulunmuştur (Tablo 1 ve Grafik 1). Taurolidine verilen tıkanma sarılıklı ve tıkanma sarılığı olmayan gruplar arasında ortalama patlama basıncı açısından istatistiksel derecede anlamlı fark saptanmamıştır. Tıkanma sarılığı olmayan Taurolidine ve SF'in verildiği gruplar arasında istatistiksel açıdan anlamlı fark saptanmamıştır.

Tablo 1. Postoperatif dönemde gelişen komplikasyonlar.

Grafik 1. Çalışma Grupları ve Patlama Basınçları.

SF verilen tıkanma sarılığı grubunun anastomoz iyileşmesinin 7. günündeki ortalama doku hidroksiprolin konsantrasyonu, Taurolidine verilen tıkanma sarılığı grubu ile tıkanma sarılığı olmaksızın SF verilen gruba göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde düşük bulunmuştur (Tablo 2ve Grafik 2). Taurolidine verilen tıkanma sarılığı olan ve olmayan gruplar karşılaştırıldıklarında anastomoz doku hidroksisprolin içeriği açısından istatistiksel açıdan anlamlı fark saptanmamıştır. Tıkanma sarılığı olmayıp, Taurolidine ve SF'in verildiği gruplar karşılaştırıldığında, istatistiksel açıdan anlamlı fark saptanmamıştır.

Tablo 2. Grupların 7.Gün Doku Hidroksiprolin Konsantrasyonları (ortalama ± SS )

Grafik 2. Çalışma Grupları ve Hidroksiprolin Konsantrasyonları.

Kontrol grubunda sham ameliyatı, tıkanma sarılığı grubunda ana safra kanalının bağlandığı cerrahi girişim öncesinde alınan kanların hiçbirinde sistemik dolaşımda TNF-α saptanmamıştır.

SF verilen tıkanma sarılığı grubunun anastomoz iyileşmesinin 7. günündeki ortalama TNF-α konsantrasyonu, Taurolidine verilen tıkanma sarılığı grubu ile tıkanma sarılığı olmaksızın SF verilen gruba göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde yüksek saptanmıştır (Tablo 3 ve Grafik 3). Taurolidine verilen tıkanma sarılığı olan ve olmayan gruplar karşılaştırıldıklarında TNF-α konsantrasyonu açısından istatistiksel açıdan anlamlı fark saptanmamıştır. Tıkanma sarılığı olmayıp, Taurolidine ve SF'in verildiği gruplar karşılaştırıldığında, istatistiksel açıdan anlamlı fark saptanmamıştır.

Tablo 3. Çalışma Gruplarının 7.Gün TNF-&#945; Konsantrasyonları (Ortalama ± SS)

Grafik 3. Çalışma Grupları ve TNF alfa Konsantrasyonları.

Hematoksilen-eozin ile boyanmış kesitlerin histopatolojik incelemesinde, tıkanma sarılığı oluşturulup SF verilen grupta, anastomoz iyileşmesinin 7. gününe ait kesitlerde, tüm tabakalarda, yer yer eksudatif karakter kazanacak kadar yoğun PMN hakimiyetiyle karakterize inflamatuar hücre infiltrasyonu, fibroblastik aktivite mevcudiyetine rağmen sarılık olmayan gruba göre daha az matriks kollajenizasyonu ve çok daha şiddetli ödemle karakterize akut inflamatuar fazda bir yara iyileşmesi görünümü hakimdi (Resim 1). Tıkanma sarılığı oluşturulup Taurolidine verilen deneklerin anastomoz iyileşmesinin 7. gününe ait kesitlerinde, SF verilen tıkanma sarılığı grubuna göre, ödemin ve tüm katlardaki inflamatuar hücre infiltrasyonunun azaldığı, hakim olan inflamatuar hücre tipinin mononükleer hücreler olduğu, fibroblastik aktiviteye eşlik eden yeni kollajen sentezinin daha fazla olduğu ve belirgin yeni damar oluşumu gözlendi (Resim 2).

Grafik 1. A. Tıkanma sarılığı oluşturulan ve SF verilen grubun barsak anastomozu iyileşmesinin yedinci gününe ait panaromik görüntü. İki ok arasında anastomoz bölgesi izlenmektedir. (S=sütür). X 100, Masson Trikrom. B. Tüm tabakalarda yoğun PMN infiltrasyonu, zayıf fibroblastik aktivite ve kontrol gruplarına göre çok daha az yeni kollajen sentezi ile karakterize, şiddetli inflamasyon fazı izlenmektedir. X400 Masson Trikrom.

Grafik 2. A. Tıkanma sarılığı oluşturulan ve Taurolidine verilen grubun barsak anastomozu iyileşmesinin yedinci gününe ait panaromik görüntü. (S=sütür, M=mukoza). X 200, Masson Trikrom. B. Tıkanma sarılığı oluşturulan ve SF verilen grubun aksine, inflamatuar hücre infiltrasyonu daha az yoğunlukta ve mononükleer hücre tipindedir. Yeni damar oluşumları (oklar) fibroblastik aktivite ve kollajen sentezinde (okbaşları) belirgin artış sağlanmıştır. X 400, Masson Trikrom.

Kontrol gruplarından SF verilen grupta, aralarında PMN'lerin olduğu yaygın mononükleer hücre infiltrasyonu, belirgin fibroblastik aktivite ve yer yer ince lifler halinde yeni kollajen sentezi ile karakterize olarak bulunmuştur. Kontrol gruplarından Taurolidine verilen grupta mononükleer hücre infiltrasyonu, yeni damar oluşumu, belirgin fibroblastik aktivite ve kollajen sentezi ile karakterize olarak bulunmuştur. Bu gruptaki inflamasyon ortamında özellikle PMN'lerin Taurolidine almayan kontrol grubuna göre daha az yoğunlukta, kollajen liflerinin ise daha belirgin olduğu izlenmiştir.

SF verilen tıkanma sarılığı grubunun anastomoz iyileşmesinin 7. günündeki median anastomoz iyileşme skoru, Taurolidine verilen tıkanma sarılığı grubu ile tıkanma sarılığı olmaksızın SF verilen gruba göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde düşük saptanmıştır (Tablo 4 ve Grafik 4). Taurolidine verilen tıkanma sarılığı olan ve olmayan gruplar karşılaştırıldıklarında anastomoz iyileşme skoru açısından istatistiksel olarak fark saptanmamıştır. Tıkanma sarılığı olmayıp, Taurolidine ve SF'in verildiği gruplar karşılaştırıldığında, istatistiksel olarak fark saptanmamıştır.

Tablo 4. Çalışma Gruplarının 7.Gün Medyan Anastomoz İyileşme skorları.

Grafik 4. Çalışma Grupları ve Anastomoz İyileşme Skorları.

Tartışma

Tıkanma sarılığının sistemik etkilerinde, anahtar rolü oynayan sistemik endotoksemidir [8]. Sistemik endotokseminin patojenik mekanizmaları arasında; artmış barsak permeabilitesi, değişmiş mukozal immunite ve izleyen bakteriyel translokasyon bulunur [16]. Tıkanma sarılığının radikal veya palyatif cerrahi girişimlerle düzeltildiği durumlar da barsak anastomozlarına sıkça başvurulur.

Barsak anastomozu iyileşmesinin kalitatif ve kantitatif değerlendirilmesinde önerilen en objektif iki yol; anastomozun kazandığı gerginlik gücünün değerlendirilmesine yönelik mekanik değerlendirmeler ve kollajen metabolizmasının durumunu belirlemeye yönelik değerlendirmelerdir [17]. Mekanik değerlendirme en sık başvurulan yöntemdir ve anastomoz patlama basıncının ölçülmesi barsak anastomozunun mekanik gücünün sınanmasında en güvenilir yöntemdir [18]. Kollajen metabolizmasındaki denge yaranın gerilim kuvvetini belirleyen değerli bir parametredir [19]. Yaranın gerilim kuvvetini kazanmasıyla, total kollajen miktarının artması arasında pozitif korelasyon olduğu bildirilmiştir[19]. Hidroksiprolin düzeyinin tayini, yaranın kollajen miktarını yansıtır [20]. İyileşen anastomozun kollajen içeriği hakkında karar verilebildiği için hidroksiprolin düzeyi ölçümleri çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır [17,21]. Tıkanma sarılığının, iyileşmekte olan yarada fibroblastların sayısını azalttığı, retiküloendotelial hücrelerin ve fibroblastların yara içine göçünü engellediği gösterilmiştir [22].

Tıkanma sarılığı oluşturulmuş ratlarda, intestinal anastomozun patlama basıncında ve doku hidroksiprolin konsantrasyonunda düşme görülmektedir [23]. Çalışmamızda Taurolidine'in, tıkanma sarılıklı ratlarda anastomozun patlama basıncını ve anastomoz doku hidroksiprolin konsantrasyonunu arttırdığı, tıkanma sarılığının ise anastomozun patlama basıncını ve anastomoz doku hidroksiprolin konsantrasyonunu azalttığı saptanmıştır. Kontrol grubu ratlarda, Taurolidine ve SF uygulaması anastomoz patlama basıncında ve anastomoz doku hidroksiprolin konsantrasyonlarında fark oluşturmamıştır. Taurolidine verilen tıkanma sarılığı olan ve olmayan ratlar kıyaslandığında anlamlı fark saptanmamıştır. Bu sonuç, Taurolidine'in tıkanma sarılığındaki yara iyileşmesi üzerine pozitif katkısı olduğunu düşündürmektedir.

Tıkanma sarılığında artmış operatif mortalite ve morbiditeden sistemik dolaşımdaki yüksek TNF-α düzeyinin sorumlu olabileceği düşünülmektedir [19,23]. Endotoksinler başlıca makrofaj ve monositleri uyararak TNF-α sentez ve salınımına neden olmaktadırlar [25]. Endotoksin ile TNF-α'nın farklı ratlara periferik dolaşımdan verilmesi ile; benzer klinik, metabolik ve histopatolojik değişikliklerin ortaya çıkması [26] TNF-α'nın endotoksin etkisi ile oluşan başlıca sitokin olduğunu düşündürmektedir.

Bemelmans ve arkadaşları, deneysel tıkanma sarılığı oluşturulan ratların çoğunda çalışma sonuna kadar periferik dolaşımda yüksek TNF-a düzeyi olduğunu bildirmişlerdir [27]. Deneysel tıkanma sarılığı modelinde, in vivo olarak sistemik TNF-α'nın major kaynağının Kupffer hücreleri olduğu gösterilmiştir [9]. TNF-α'nın yara iyileşmesi aşamalarında, kollajen setezine down-regülasyon şeklinde etki ettiği [10] ve TNF-α'nın yara iyileşmesi sırasında yeni granulasyon dokusu üretimini azaltarak inflamatuar fazı inhibe ettiği gösterilmiştir [28]. TNF-α'nın, in vitro çalışmalarda fibroblastlardaki kollajen transkripsiyonunu ve prokollajen-a1 mRNA düzeyini düşürdüğü [29] ve fibroblastlardan kollajenaz enziminin salınımını arttırarak ölçülebilen kollajen miktarını azalttığı da rapor edilmiştir [11]. Lipopolisakkarit (endotoksin) verilen ratlarda verilmeyenlere göre daha yüksek TNF-α konsantrasyonları, daha düşük anastomoz patlama basıncı ve doku hidroksisprolin konsantrasyonu saptanmıştır [30]. Çalışmamızda tıkanma sarılığı oluşturulup SF verilen grupta, tıkanma sarılığı oluşturulmadan SF verilen gruba göre 7. günde ortalama TNF-α konsantrasyonlarının yüksek olduğu saptanmıştır. Bu iki grupta, ortalama anastomoz patlama basıncı, ortalama anastomoz doku hidroksiprolin konsantrasyonu ve medyan anastomoz iyileşme skoru açısından tıkanma sarılığı oluşturulup SF verilenlerde anlamlı yükseklik saptandı. Bu sonuçlar literatürle uyumludur. Periferik dolaşımdaki bu yüksek TNF-α konsantrasyonları, yara iyileşmesinin inflamasyon fazını şiddetlenmesine ve uzamasına, artmış kollajen yıkımına, yeni kollajen sentezi ve fibroblastik aktivitede azalmaya ve böylece kötü yara iyileşmesine sebep olabilir.

N-klorotaurine, bakteriosidal etkili olup aktive makrofajlardan TNF-α ve NO sentezini inhibe eder[13]. Taurolidine verilen tıkanma sarılığı grubunda Taurolidine verilmeyen gruba göre ortalama TNF-α konsantrasyonu istatistiksel anlamda düşük bulunmuştur. Taurolidine verilen tıkanma sarılığı grubu ile tıkanma sarılığı olmayan grup TNF-α açısından kıyaslandığında arada anlamlı fark saptanmamıştır. Burada da tıkanma sarılığı ile birlikte Taurolidine'nin, TNF-α düzeyini etkin bir şekilde düşürdüğünü görmekteyiz. Ancak kontrol grubu ratlarda (Grup 3 ve 4), Taurolidine ve SF uygulaması ile TNF-α açısından medyan ve maksimum değerlerde fark olmasına rağmen, bu farkın istatistiki değerlere yansımadığı saptandı. Bu sonuç, TNF-α düzeylerinin sham ameliyatı gruplarında, normal travma yanıtının çok üzerine çıkmamış olmasına bağlı olabileceğini düşündürdü.

Histopatolojik inceleme ise ancak yara iyileşmesinin son durumunu belirlemede, özellikle de belirli hücre tiplerinin yaraya infiltrasyonunun takibinde faydalı olabilmektedir ve subjektif bir değerlendirme metodudur [31]. İn vivo ve in vitro çalışmalara göre endotokseminin başlangıç olaylarından biri nötrofil aracılı endotelial hasardır [32,33]. İnflamatuar ve mezenşimal hücrelerin; lipopolisakkaritlere ve sitokinlere yanıt olarak, tetiklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) vasıtası ile argininden büyük miktarlarda NO sentez ettikleri görülmüştür [34]. Anastomoz iyileşme esnasında iNOS aktivitesinin postoperatif 1. günde maksimum olduğu ve postoperatif 3. ve 5. günlere doğru azaldığı gösterilmiştir. Taurine doğal antioksidan olup, endotelial koruyucudur ve hücre koruyucu olan yapısal nitrik oksit sentazın (cNOS) sentezini arttırır, endotoksemide gözlenen hemodinamik instabilitenin ana mediatörü olduğu düşünülen iNOS'un bilinen endojen tek inhibitörüdür [35]. N-klorotaurine, lökositlerin içerisine girerek aktif olarak taşınabilir ve inflamatuar mediatörlerin üretimini azaltabilir [36]. Tıkanma sarılığı, nötrofil aktivasyon ve agregasyonuna, mezenkimal hücrelerden proteolitik enzimlerin açığa çıkışına ve böylece doku hasarına sebep olur [37]. Egan ve arkadaşlarının çalışmasında [12], deneklere endotoksin verilmesi nötrofil infiltrasyonunun bir göstergesi olan pulmoner myeloperoksidaz düzeylerini dramatik bir şekilde artırırken, Taurolidine verilen deneklerde pulmoner myeloperoksidaz düzeylerinde önemli derecede düşüş gözlenmiştir. PMN'ler postoperatif 1. günden başlayarak 3. günde maksimum düzeye ulaşırlar. Histopatolojik olarak postoperatif 7. günde en düşük seviyededirler. Mononükleer hücreler tedrici artar ve postoperatif 7. günde en yüksek seviyededir ve anastomoz etrafındaki ödem postoperatif 1. günde en yüksek olup, giderek azalır ve postoperatif 7. günde en düşük seviyededir [38]. Çalışmamızda tıkanma sarılığı oluşturulup SF verilen grupta, anastomoz iyileşmesinin 7. gününe ait kesitlerde, tüm tabakalarda, yer yer eksudatif karakter kazanacak kadar yoğun PMN hakimiyetiyle karakterize inflamatuar hücre infiltrasyonu, belirgin yeni damar oluşumu, fibroblastik aktivite mevcudiyetine rağmen, sarılığı olmayan gruba göre daha az matriks kollajenizasyonu ve çok daha şiddetli ödemle karakterize akut inflamatuar fazda bir yara iyileşmesi görünümü hakimdi. Tıkanma sarılığı oluşturulup SF verilen grup, SF verilen kontrol grubuna göre medyan anastomoz iyileşme skoru açısından anlamlı derecede düşüktü.

Tıkanma sarılığı oluşturulup Taurolidine verilen deneklerin anastomoz iyileşmesinin 7. gününe ait kesitlerinde, SF verilen tıkanma sarılığı grubuna göre, ödemin ve tüm katlardaki inflamatuar hücre infiltrasyonunun azaldığı, hakim olan inflamatuar hücre tipinin mononükleer hücreler olduğu, fibroblastik aktiviteye eşlik eden yeni kollajen sentezinin daha fazla olduğu gözlendi. Bu iki grup medyan anastomoz iyileşme skoru açısından da karşılaştırıldığında Taurolidine verilen grupda istatistiksel derecede anlamlı yükseklik saptanmıştır. Taurolidine verilen tıkanma sarılığı olan ve olmayan gruplar medyan anastomoz iyileşme skoru açısından karşılaştırıldığında anlamlı fark yoktu. Bunda da Taurolidine'in tıkanma sarılığındaki bozulmuş yara iyileşmesine pozitif katkısı olduğu düşünülebilir. Kontrol gruplarında ise Taurolidine ve SF uygulamasıyla medyan anastomoz iyileşme skoru açısından anlamlı fark saptanmamıştır.

Sonuç

Çalışmamızda, tıkanma sarılığı modelinde periferik dolaşımda TNF-α düzeyleri yüksek olarak bulunmuş, kolonik anastomozda ise düşük patlama basınçları ve düşük hidroksiprolin konsantrasyonu saptanmıştır. İntraperitoneal uygulanan Taurolidine'in, yüksek TNF-α düzeylerini düşürdüğü ve uygulanan kolonik anastomozda patlama basıncı ve hidroksiprolin konsantrasyonunu pozitif yönde etkilediği görülmüştür. Taurolidine'in tıkanma sarılığı olmayan kontrol grubunda kullanımının intestinal anastomoz iyileşmesi üzerine etkisi saptanmamıştır. Barsak anastomozlarının sıklıkla yapıldığı tıkanma sarılığında Taurolidine kullanımı anastomoz iyileşmesine olumlu yönde katkıda bulunabilir.

Kaynaklar

1. Askew AR, Bates GJ, Balderson G. Jaundice and the effect of sodium taurocholate taken orally upon abdominal wound healing. Surg Gynecol Obstet, 159:207-209, 1984.
2. Cainzos M, Alcade JA, Potel J, et al. Hyperbilirubinemia, jaundice and anergy. Hepato-Gastroenterology, 39:330-332, 1992.
3. Scott-Conner CE, Grogan JB. The pathophysiology of biliary obstruction and its effect on phagocytic and immune function. J Surg Res, 57:316-336, 1994.
4. Shamber R. Effect of chemotherapy and radiotherapy on wound healing: experimental studies. Recent Results Cancer Res;, 98:17-34, 985.
5. Deitch EA, Sittig K, Li M, et al. Obstructive jaundice promotes bacterial translocation from the gut. Am J Surg, 159:79-84, 1990.
6. Ding JW, Andersson R, Soltesz VL, et al. Inhibition of bacterial translocation in obstructive jaundice by MTPPE in the rat. J Hepatol, 20:720-728, 1994.
7. Wang XD, Parsson H, Anderson R. Bacterial translocation, intestinal ultrastructure and cell membrane permeability early after major liver resection in the rat. Br J Surg, 81:579-584, 1994.
8. Clements WDB, Erwin P, McCaigue MD, et al. Conclusive evidence of endotoxaemia in biliary obstruction. Gut 1998; 42:293-299.
9. Kennedy JA, Lewis H, Clements WDB, et al. Kupffer cell blockade, tumor necrosis factor secretion and survival following endotoxin challenge in experimental biliary obstruction. Br J Surg., 86:1410-1414, 1999.
10. Regan MC, Kirk SS, Hurson M, et al. Tumor necrosis factor-alfa inhibits in vivo collagen synthesis. Surgery, 113:173-177, 1993.
11. Dayer JM, Beutler B, Cerami A. Cachectin / tumor necrosis factor stimulates collagenase and prostoglandin E2 production by human synovial cells and fibroblasts. J Exp Med, 162:2163-2168, 1985.
12. Bridget ME, David JB, Claire C, et al. Taurolidine attenuates the hemodynamic and respiratory changes associated with endotoxemia. Shock, 17: 308-311, 2002.
13. Schuller LG, Quinn MR, Wrigt C, et al. Taurine protects against oxidant induced lung injury:possible mechanisms of action. Adv Exp Med Biol, 359:31-39, 1994.
14. Jamall IS, Finelli VN, Que Hee SS. A simple method determine nanogram levels of 4-Hydroxyproline in biological tissues. Analytical Biochemistry, 112:70-75, 1981.
15. Graham MF, Willay A, Adams J, et al. Role of ascorbic acid procollagen expression and secretion by human intestinal smooth muscle cells. J Cell Physiol, 162:225-231, 1995.
16. Welsh FKS, Ramsden CW, Maclennan K, et al. Increased intestinal permeability and altered mucosal immunity in cholestatic jaundice. Ann Surg, 227:205-212, 1998.
17. Hendriks T, Mastboom WJ. Healing of experimental intestinal anastomoses. Parameters for repair. Dis Colon Rectum, 33:891-901, 1990.
18. Koloğlu M, Yorgancı K, Renda, et al. Effect of local and remote ischemia-reperfusion injury on healing of colonic anastomoses. Surgery, 128:99-104, 2000.
19. Madden JW, Pecock EE Jr. Studies on the biology of collagen during wound healing. Surgery, 64:306-309, 1968.
20. Cohen IK, Diegelmann RF, Yager DR, Wornum III IL, Graham M, Crossland MC. Wound care and wound healing. In: Principles of Surgery. 7 th ed. Ed: Schwartz SI, Shires GT, Spencer FC, Daly JM, Fischer JE, Gallloway AC. McGraw-Hill Companies, s.263-298, 1999.
21. Koruda MJ, Rolandelli RH. Experimental studies on the healing of colonic anastomoses. J Surg Res, 48:504-515, 1990.
22. Lee E. The effect of obstructive jaundice on the migration of reticulo-endothelial cells and fibroblasts into early experimental granulomata. Br J Surg, 59:207-209, 1972.
23. Sayan M, Alponat A, Yavuz N, et al. The effect of sodium taurocholate on endotoxemia and intestinal anastomotic wound healing in rats with obstructive jaundice. Surg Today, 27:953-957, 1997.
24. Michie HR, Manouge KR, Spriggs DR, et al. Detection of circulating tumor necrosis factor after endotoxin administration. N Eng J Med, 318:1481-1486, 1988.
25. Kelkel HC, Oppenheim JD, Stone-Wolff D, et al. Characterization of human tumor necrosis factor produced by peripheral blood monocytes and its seperation from lymphotoxin. Int J Cancer, 36:69-72, 1985.
26. Tracey KJ, Beytler B, Lowry SF, et al. Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin. Science, 234:470-474, 1986.
27. Bemelmans MHA, Greve JW, Gouma DJ, et al. Cytokines tumor necrosis factor and interleukin-6 in experimental biliary obstruction in mice. Hepatology, 15:1132-1136, 1992.
28. Rapala K, Peltonen J, Heino J, et al. Tumor necrosis factor-alpha selectively modulates expression of collagen genes in rat granulation tissues. Eur J Surg, 163:207-214, 1997.
29. Solis-Herruzo JA, Brenner DA, Chojkier M. Tumor necrosis factor alfa inhibits collagen gene transcription and collagen synthesis in cultured human fibroblasts. J Biol Chem, 263:5841-5845, 1988.
30. Leaper DJ. Prevention of peritoneal adhesion after thermal injury using Noxythiolin and Taurolidin. In: Brückner WL, Pfirrmann, R. W.:Taurolin: Einneues Konzept zur antimikrobiellen Chemotherapie chirurgischer Infektionen. Munich: Urban, Schwarzenberg, 115-119, 1985.
31. Hesp WL, Hendriks T, Schillings PH, et al. Histological features of wound repair: a comparison between experimental ileal and colonic anastomosis. Br J Exp Pathol, 66:511-538, 1985.
32. Graham MF, Drucker BE, Diegelman RF, et al. Collagen synthesis by human intestinal smooth muscle cells in culture. Gastroenterology, 92:400-405, 1987.
33. Hickey MJ, Issekutz PH, Reinhardt PH, et al. Endogenous interleukin-10 regulates hemodynamic parameters, leucocyte-endotehelial cell interactions, and microvascular permeability during endotoxemia. Cir Res, 83:1124-1131, 1998.
34. Çolak T, Naycı A, Polat G, et al. Effect of tradıpıl on the healıng of colonıc anastomoses in an experimental rat model. ANZ J: Surg, 73:916-921, 2003.
35. Fennessy F, Smith G, Kelly C, et al. Taurine restores endothelial-dependent but not independent dysfunction in young cigarette smokers. Br J Surg 1998; 85:1582-1587.
36. Georgia B.,Schuller-Levis, Eunkyue Park. Taurine: new implications for an old amino acid. FEMS Microbiol Lett, 226: 195-202, 2003.
37. Cotran Rs, Kumar V, Collins T. Red cells and bleeding disorders. In: Cotran RS, Kumar V, Collins T, eds. “Pathologic Basis of Disease”, 6. Edition, Philedalphia; WB Saunders Company,; s.73, 1999.
38. Verhofstad MH, Lange WP, van der Laak JA, et al. Microscopic analysis of anastomotic healing in the intestine of normal and diabetic rats. Dis Colon Rectum, 44:423-431, 2001.