Turkish Journal of Surgery

Turkish Journal of Surgery

ISSN: 2564-6850
e-ISSN: 2564-7032

 

Zafer Önen1, Özer Makay1, Gökhan İçöz1, Gökhan Özgen2, Çiğdem Yenisey3, Nilüfer Genç Şimşek3, Mahir Akyıldız1, Enis Yetkin1

1Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi, Genel Cerrahi AD, İZMİR
2Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi, İç Hastalıkları AD, Endokrinoloji BD, İZMİR
3Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi, Biyokimya AD, AYDIN

Özet

Amaç: Nitrik oksitin deneysel hipertiroidizmdeki rolünü ve melatoninin nitrik oksit yanıtına etkisini araştırmak.

Durum Değerlendirilmesi: Hipertiroidizm, serbest oksijen radikali üretimine, serbest oksijen radikalleri de hücrede hasara neden olmaktadır. Metabolizma düzenlenmesinde etkin rol oynayan bir hormon olan melatonin, direkt antioksidan etkisiyle nitrik oksit (NO) gibi oksidatif strese yol açan serbest radikallerin biyomoleküller üzerindeki zararlı etkilerini önler.

Gereç ve Yöntem: Çalışmada 30 adet Wistar Albino dişi sıçan üç grup olarak randomize edildi. Grup A'ya (negatif kontrol grubu) intraperitoneal serum fizyolojik; Grup B'ye (pozitif kontrol grubu) intraperitoneal 0,2 mg/kg/gün L-tiroksin ve Grup C'ye (tedavi grubu) intraperitoneal 0,2 mg/kg/gün L-tiroksinin ile birlikte intraperitoneal 3 mg/kg/gün melatonin uygulandı. Üçüncü hafta sonunda, tüm sıçanlar dekapite edilerek serum, karaciğer ve kalp dokularından örneklemeler yapıldı. Biyokimyasal olarak kan ve dokuda serbest T3 (FT3), serbest T4 (FT4), tiroid stimulan hormon (TSH) ve NO düzeyleri araştırıldı.

Bulgular: Kan FT3 düzeyi açısından, Grup A ve B ile Grup B ve C arasında, istatistiksel olarak anlamlı fark izlendi (p<0.001 ve p=0.004, sırasıyla). Grup A ve B ile Grup A ve C arasında, kan FT4 düzeyleri açısından istatistiksel olarak anlamlı fark izlendi (p<0.001 ve p=0.02, sırasıyla). Median değerleri sırasıyla 5,93 μM/L; 48,41 μM/L ve 42,69 μM/L olan kan NO düzeyleri de gruplar arasında anlamlı fark gösterdi (p<0.001). Kalp NO median değerilerine bakıldığında, B grubunda A grubu ile aynı (1,74 µmol/g'a karşın 1,74 µmol/g) olduğu ve bu değerin C grubunda baskılandığı (1,25 µmol/g), ancak bu yanıtın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı görüldü (p=0,05). Karaciğer NO düzeyleri arasındaki fark ise, Grup A ve B arasında anlamlı bulunurken (p<0.001) Grup B ve C arasında anlamlı değildi (0,30 µmol/g; 0,46 µmol/g ve 0,41 µmol/g, sırasıyla).

Sonuç: Bu çalışmanın, melatoninin değişik dozlarda ve/veya zaman aralıklarında uygulanımıyla yapılacak çalışmalarla doğrulanması ve desteklenmesi halinde; birçok klinik alanda kullanıma girdiği bildirilen melatonin ile hipertiroidizm gibi tüm sistemleri etkileyen patolojilerle savaşımda, yeni açılımlar sağlanabileceği inancındayız.

Anahtar Kelimeler: Hipertiroidizm, nitrik oksit, melatonin, serbest oksijen radikalleri

Giriş

Hipertiroidizm, hücredeki oksijen metabolizmasını etkileyerek serbest oksijen radikalleri üretimine neden olmaktadır. Serbest oksijen radikalleri, hücrelerde DNA hasarına, lipit peroksidasyonuna, enzim inaktivasyonuna ve aktivasyonuna neden olur. Sonuçta, bu reaktif bileşikler hücrede oksidatif hasara neden olurlar[1]. Nitrik oksit tanımlanan serbest oksijen radikallerinden biridir[2].

Aerobik canlılarda, serbest oksijen radikalleri oluşumuyla birlikte, bu radikallerin zararlı etkilerini önlemek amacıyla antioksidan savunma sistemleri gelişmiştir[3,4]. Süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz ve katalaz gibi enzimler ve vitaminler ile tiyoller gibi enzim olmayanlar şeklinde yapılarına göre sınıflandırılabilen antioksidanlar, serbest radikallerin lipidler, proteinler, nükleik asitler gibi hedef biyomoleküllere vereceği hasarı önleyebilmektedir[3,5]. Son yıllarda, endojen savunma sistemini güçlendirmek amacıyla, organizmada doğal olarak bulunan savunma sistemlerinin bir kısmı ya da antioksidan özellik gösteren bazı farmakolojik ajanlar da kullanılmakta ve bu bileşikler, ekzojen savunma sistemleri olarak adlandırılmaktadır.

Çeşitli antioksidanların gücünü belirlemek amacıyla yapılan karşılaştırmalı çalışmalar, melatoninin en güçlü antioksidanlardan biri olduğunu göstermektedir. Askorbat alfa-tokoferol ve glutatyon gibi zincir reaksiyonlarını kırabilen diğer antioksidanlardan farklı olarak, melatonin yayılmakta olan lipid peroksidasyonunu peroksil radikalini yakalayarak sonlandırmaktadır[6]. Melatonin gibi güçlü bir antioksidanın, patogenezinde serbest radikal hasarı olduğuna inanılan Alzheimer hastalığı, sepsis, iskemi/reperfüzyon hasarı, tardiv diskinezi gibi patolojilerde, klinik kullanıma da girdiği bildirilmektedir[1,7-9]. Hipertiroidizmde ise oksidatif stres ile ilgili çalışmalar yapılmış olsa da, bu çalışmalar yeterli sayıda değildir. Nitrik oksitin hipertiroidizm ile ilişkisi ise iyi bilinmemektedir. Tüm bunlar göz önünde bulundurulduğunda, bu çalışma ile hipertiroidili sıçanlarda melatonin uygulanımının, nitrik oksit üzerindeki etkisini ortaya koymaya amaçladık.

Gereç ve Yöntemler

Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanan bu çalışma (Sayı: 2006-30), Ekim-Aralık 2006 tarihleri arasında Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel Cerrahi Laboratuarında gerçekleştirildi. Çalışma, 24 ± 1 °C'lik oda ısısı ve 12'şer saatlik gece-gündüz döngüleri olan standart laboratuar koşulları altında uygulandı. Sıçanların bakımı, optimum koşullarda, dört hafta süreyle deneysel cerrahi laboratuarında sağlandı. Deney öncesinde sıçanlar 10 gün ortama alıştırıldı. Hipertiroidi oluşturulması ve melatonin uygulanması UFAW Laboratuar Hayvanları Yönetimi ve Bakımı El Kitabı'ndaki (Blackwell Yayınevi, 7.Baskı, Iowa, 1999, Blackwell Science) ölçütlere uyularak gerçekleştirildi.

Ortalama ağırlıkları 200–240 gr olan 30 adet Wistar Albino dişi sıçan şu gruplara randomize edildi (randomizasyon için deneklerin ağrırlıkları kaydedilerek bilgisayar eşliğinde gerçekleştirildi);

• Grup A (n=10) Herhangi bir işlem görmeyen grup (sham grubu)
• Grup B (n=10) Tedavi almayan hipertiroidi grubu (kontrol grubu)
• Grup C (n=10) Melatonin uygulanan hipertiroidi grubu (tedavi grubu)

Tirotoksikoz, intraperitoneal olarak, 0,2 mg/kg/gün pozolojisi ile 7 gün boyunca uygulanan L-tiroksin (Sigma) ile oluşturuldu. L-tiroksin; 0,01 N NaOH'de çözdürülüp, serum fizyolojik ile sulandırıldı.

Grup C'de yer alan sıçanlara L-tiroksin ile aynı anda melatonin verildi. İlaç, 3 mg/kg/gün dozda, intraperitoneal olarak toplam 7 gün uygulandı. Toz halindeki melatonin (Sigma), %99 etanol ile çözelti haline getirildi ve enjeksiyon öncesi salin solüsyonunda seyreltildi. Hazırlanan çözelti, son haliyle, etanol konsantrasyonu %1 ve oluşturulan solüsyonun her 1 ml'sinde 10 mg melatonin içerir hale getirildi.

Üçüncü hafta sonunda tüm sıçanlar dekapite edilerek kan örneklerinin yanı sıra karaciğer ve kalp dokularından örneklemeler yapıldı. Biyokimyasal olarak kan ve dokuda FT3 , FT4, TSH ve nitrik oksit (NO) düzeyleri araştırıldı.

Biyokimyasal Değerlendirme
Doku örneklerinin alınması ve saklanması:
Doku örnekleri, sıçanlar kesildikten sonra soğuk zincir ile taşındı ve –85ºC'lik derin soğutucuya kondu. Doku NO (nitrit+nitrat) ölçümleri için, doku homojenize edildiği gün süpernatant alınıp, %30'luk ZnSO4 ile deproteinize edildi, santrifüjlendi ve yine ileride çalışılmak üzere -85ºC'de donduruldu. Dokuların homojenizasyonu, doku homojenizasyon tamponu ile 1:10 (w/v) olacak şekilde yapıldı. Doku homojenizasyon tamponu (1mM, pH:7.4); fenilmetilsulfonilflorür (C7H7FO25, Sigma, Kat. No. P-7626), di-sodyumhidrojenfosfat (Na2HPO4.2H2O, Merck, Kat. No. K25979680), potasyumdihidrojenfosfat (H2KPO4, Merck, Kat. No. A986373), etilendiamintetraasetik asit-disodyum (Na2EDTA) (C10H14N2O8Na2. 2H2O, Sigma, Kat. No. E-1644) kullanılarak hazırlandı.

Kan örneklerinin alınması ve çalışılması:
Kan örnekleri, intrakardiak olarak alındı. Ölçüm birimleri olarak; kan nitrik oksit için μM/L, FT3 için pq/mL, FT4 için ng/dL ve TSH için μ IU/mL kullanıldı. Referans aralıkları; FT3 için 1,8-4,6 pq/mL, FT4 için 0,93-1,7 ng/dL ve TSH için 0,27-4,2 μ IU/mL'dir. Örneklerin ölçümleri, BIODPC firmasının IMMULATE 2000 Hormon Analizör'ünde, kemilüminans immunoassay ile ticari kitler kullanılarak tamamlandı.

NO (nitrit+nitrat) ölçüm yöntemi:
Bioxytech (Kat. No. 22116) yöntemi modifiye edilerek manuel yöntemle saptandı. Kadmiyum (Fluka, Kat. No. 20890) granülleri kullanıldı. Glisin-NaOH tamponu; glisin (C2H5NO2, Merck, Kat. No. K23214990) ve sodium hidroksid (NaOH, Prolabo, Kat. No. EMB 45053) kullanılarak hazırlandı. Glisin NaOH tamponu içindeki CuSO4 çözeltisi; glisin, NaOH ve bakır sülfat (CuSO4, Merck, Kat. No. 4187427) kullanılarak hazırlandı. Sülfanilamid çözeltisi; hidroklorid asid %37 (HCl, Merck, Kat. No. K24016914) ve sülfanilamid (C6H8N2O2S, Sigma, Kat. No. S-9251) ile hazırlandı. NED çözeltisi; N-(1-Naphtyl) Etil-Enediamin dihidroklorür (C12H14N2. 2HCl, Sigma, Kat. No. N-5889) kullanılarak hazırlandı. Standartlar; sodyum nitrit (NaNO2, Sigma, Kat. No. S-3421) kullanılarak, 10-100 μg konsantrasyonlarda hazırlandı. Örneklerdeki nitrit ve nitrat konsantrasyonları Griess reaksiyonu sonucunda ölçüldü. Örnekler ve standartlar, ELISA yöntemiyle 540 nm'de okutuldu. Konsantrasyon hesapları otomatik olarak cihaz tarafından hesaplanmış olup, doku hesaplamaları sonucunda, sonuçlar µmol/g yaş doku olarak verildi.

İstatistiksel analiz
Çalışma verileri, Microsoft Excel programına kaydedilerek toplandı. Verilerin istatistiksel analizi SPSS (sürüm 15,0) istatistik programı kullanılarak gerçekleştirildi. Verilerin ortanca ve çeyreklikler arası dağılım genişliği (IQR: interquartile range) değerleri kullanıldı. Grup değerleri, tüm verilerde Kruskal-Wallis tek yönlü varyans analizi ile karşılaştırıldı. Grupların ikili analizinde Mann-Whitney U testi uygulandı. Bütün testlerde bulunan p<0.05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Bulgular

FTз düzeyleri
Kan FTз düzey ortalamalarının, B grubunda, A grubu ortalamasına göre artış gösterdiği ve bu farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptandı (p<0.001). C grubu ortalamasının, B grubu ortalamasının altında olduğu, bunun da istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptandı (p=0.004) (Tablo 1).

FT4 düzeyleri
Kan FT4 ortalamalarının, B ve C gruplarında A grubuna göre anlamlı artış gösterdiği (p<0.001 ve p=0.02, sırasıyla), B ve C grupları arasında anlamlı fark olmadığı görüldü (p=0.23) (Tablo 1).

TSH düzeyleri
Kan TSH düzeyleri, B ve C gruplarında, A grubu ile karşılaştırıldığında, baskılanmış olsa da bu durum gruplar arası istatistiksel olarak anlamlı değildi (p=0.38) (Tablo 1).

Kan NO düzeyleri
B grubunun kan NO düzeyi, A grubu ile karşılaştırıldığında, meydana gelen artışın anlamlı olduğu (p<0.001), C grubu ile karşılaştırıldığında ise, C grubundaki azalmanın anlamlı olduğu tespit edildi (p<0.001) (Tablo 2).

Kalp ve karaciğer NO düzeyleri
Kalp NO düzeyleri, her ne kadar C grubunda B grubuna göre daha düşük saptanmış olsa da aradaki farklar istatistiksel olarak anlamlı değildi (p=0.07 ve p=0.05, sırasıyla) (Tablo 2). Karaciğer NO düzeyi ise B grubunda, A grubuna göre daha yüksekti (p<0.001). Ancak C grubunda elde edilen yanıt istatistiksel olarak anlamlı değildi (p=0,18) (Tablo 2).

Tartışma

Literatüre bakıldığında hipertiroidizmin oksidatif strese etkisi ve antioksidan mekanizmalarda oluşan değişiklikler ile ilgili araştırmaların birçoğu deneysel hayvan modellerinde çalışılmıştır[1014]. İnsanlarda hipertiroidizme bağlı olarak tedavi öncesi ve sonrasında serum, plazma ve eritrosit antioksidan sistemlerinde meydana gelen değişiklikler ile ilgili çalışmalar daha azdır[1517]. Literatürde hipertiroidizm kaynaklı oksidatif stresi önlemeye yönelik tedavilerin etkinliğini irdeleyen çalışma sayısı da oldukça azdır. Biz de bu çalışmada bir proantioksidan ve doğrudan serbest radikal avcısı olan melatoninin, NO düzeyleri üzerine etkisini araştırdık. Moğulkoç ve ark.[10] bu konudaki çalışması bizim çalışmanın şekillenmesinde etkili oldu. İlgili çalışmada deneysel hipertiroidinin oksidatif strese neden olduğu, MDA ve GSH düzeylerinin etkilendiği ve melatoninin farklı dokularda oksidatif hasarı engellediği ortaya konmaktadır.

Hipertiroidizm geliştirilmiş sıçanlarda tiroid hormonunun bazı dokularda oksidatif stresi indükleyebildiği, karaciğer, kalp ve kas dokusunda lipid peroksidasyonunu ve karaciğerde protein oksidasyonunu artırdığı gösterilmiştir[11,12]. Bununla birlikte altta yatan temel mekanizma tam anlaşılabilmiş değildir. Ancak gelişmiş floresans tekniğiyle yapılan çalışmalarla, tiroid hormon seviyesindeki değişikliklerin, dokuya özgün değişikliklerle ilişkili olduğu ortaya konulmuştur. Bununla birlikte, bu çalışmalarda, hipertiroidili sıçanlarda kalp ve karaciğer üzerinde antioksidan kapasitenin azaldığı gözlenmiştir[12].

Nitrik oksidin memeli hücrelerinde meydana gelen oksidatif stres yanıtı sonucu, NOS aracılığıyla L-arginin'den üretilen bir serbest radikal olduğu bilinmektedir. Fizyolojik konsantrasyonlarda reaktif olmayan ve normal koşullarda enzim aktivasyonuyla c-GMP üretiminde rol alan NO, oksidatif stres yaratan herhangi bir durumda reaktif bileşiklerine dönüşmektedir. Böylece biyolojik moleküllere hasar verebilen güçlü oksidan yapıya kavuşmaktadır. Bu çalışmada tirotoksikoz oluşturulan sıçanlarda kan ve doku NO düzeylerinin arttığı ve NO'in en güçlü antioksidanı olduğu iddia edilen melatoninin, artmış NO düzeylerine etki ettiği ortaya konuldu.

Doksanlı yılların başında, melatoninin hidroksil iyonu temizleyici özelliği keşfedilmiştir. Daha sonrasında, melatoninin çeşitli oksidatif stres modellerine karşı koruyucu etkisi birçok çalışmada gösterilmiştir[13]. Melatoninin reaktif oksijen-nitrojen ürünlerini, peroksinitrit ve onların metabolitlerini ve hidrojen peroksidi detoksifiye ettiği saptanmıştır. Bununla birlikte, melatoninin, klinik kullanım açısından, birtakım ilgi çekici özellikleri belirlenmiştir: bütün yapısal bariyerleri (kan, beyin ve plasentayı) kolayca geçebilmesi, mitokondriyal fonksiyonları koruması, klinik uygulamalarda emilmeye hazır halde olması ve düşük toksisiteye sahip olması nedeniyle klinikte kullanım alanı bulmaya çalışmıştır[13].

Bu çalışmada melatoninin hangi mekanizma ile kan NO düzeylerini baskıladığını belirlemek mümkün değildir. Melatonin, doğrudan antioksidatif özelliğini kullanarak bu etkiyi gösteriyor olabilir. Ancak öte yandan, bu çalışmanın hipotezinde ön görmediğimiz, melatonin kullanımı ile ortaya çıkan bir T3 inhibisyonu söz konusudur. Melatoninin T4 deiyodinizasyonunu engellediğini belirten bir çalışmaya literatürde rastlanmamaktadır. Bu konunun bu açıdan araştırılmaya değer olduğu düşüncesindeyiz. Bunun yanı sıra, deneysel hipertiroidi ile ortaya çıkan oksidatif stres yanıtında nitrik oksitin inflamatuar sitokinler ile ilişkisi olabilir ve melatonin bu sitokin yanıtı üzerinden etki gösterebilir. Bu hipotezi doğrulamak üzere, tarafımızca aynı deneysel model üzerinde çalışılmış ve bu modelin ikinci ayağında irdelenen sonuçlar henüz değerlendirilme aşamasındadır.

Kan NO'nin yanı sıra, çalışmada kalp ve karaciğer NO düzeyleri de ölçüldü. Tüm sistemlere etkisi olduğu bilinen hipertiroidinin sıçanlarda karaciğer ve kalp dokularındaki antioksidan savunma sisteminin etkinliğini ciddi ölçüde azalttığı bir gerçektir[2]. Fernandez ve ark.[14] yaptığı bir çalışmada, T3 uygulamasının, sıçan karaciğerinde NOS aktivitesine neden olduğu ortaya konulmuştur. Bu çalışmada, artmış NOS aktivitesinin T3 preparatı kesildikten sonra normale döndüğü gözlenmiştir. Nitrik oksidin karaciğerdeki sentezi, hem hepatositlerde hem de Kupffer hücrelerinde gerçekleşmektedir[18,19]. Tiroid hormonu uygulanımının, karaciğerde peroksinitrit (ONOO¯) formasyonuna ve böylece oksidan durumun artmasına neden olduğu bilinmektedir[20]. Hipertiroidili karaciğerde gözlenen değişikliklerin, tiroid hormonlarının sistemik etkilerinden mi kaynaklandığı ya da tiroid hormonlarının karaciğer üzerindeki direkt toksik etkisinden mi kaynaklandığı açık değildir. Bununla birlikte, bu konuda yapılan çalışmalar tiroid hormonlarının karaciğerde oksidatif strese neden olup, hücresel düzeyde mitokondriler ve plazma membranlarını etkileyerek, lipid ve protein oksidasyonuna yol açtığı düşünülmektedir. Bizim çalışmamızda, hipertiroidi oluşturulan grupta, karaciğer NO düzeyindeki artış istatistiksel olarak anlamlı iken, melatonin ile tedavi verilen grupta ortalama %20 oranında yanıt alınmasına rağmen, aradaki fark istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. Konu ile ilgili veri sayısı az olduğundan, benzer modellerde karaciğer NO düzeyinin melatonine nasıl yanıt vereceği konusuna açıklık getirecek daha geniş kapsamlı çalışmalara ihtiyaç olduğu görülmektedir.

Deneysel olarak hipertiroidinin kalp dokusu üzerine etkisini inceleyen iyi tasarlanmış çalışmaları model olarak aldığımızda, bu çalışmada uygulanan tiroid hormon replasmanı sonucunda kalp NO düzeylerindeki artışın, karaciğer NO düzeylerindeki artış kadar belirgin olmadığı görüldü. Karaciğer dokusu ile karşılaştırıldığında NO düzeyi her ne kadar kalp dokusunda daha yüksek konsantrasyonda mevcut olsa da, hipertiroidinin oluşturulması ile ortaya çıkan artış ve melatoninin bu artışa olan cevabı istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. Yapılan çalışmalarda, hipertiroidide kalp dokusunda ortaya çıkan değişikliklerin, artmış oksidatif hasarın direkt etkisinden çok, kalp dokusunun oksidatif yanıta olan azalmış savunma etkisinden dolayı meydana geldiği bildirilmektedir[11].

Sonuç olarak, yaptığımız bu çalışma ile, sıçanlarda geliştirilen deneysel hipertiroidizm modelinde; hipertiroidi ile kan, kalp ve karaciğer nitrik oksit düzeylerinin arttığı gösterilmiş ve hipertiroidi durumu ile ilişkilendirilen kan NO formasyonunun, melatonin tedavisine yanıt verdiği ortaya konulmuş oldu. Bu çalışmanın, melatoninin değişik dozlarda ve/veya zaman aralıklarında uygulanımıyla yapılacak diğer çalışmalarla doğrulanması ve desteklenmesi halinde, hipertiroidizmin tedavisinde yeni açılımlar sağlanabileceği inancındayız.

Kaynaklar

  1. Asayama K, Kato K. Oxidative muscular injury and its relevance to hyperthyroidism. Free Radic Biol Med 1990;8:293-303.
  2. Venditti P, Di Meo S. Thyroid hormone-induced oxidative stress. Cell Mol Life Sci 2006;63:414-434.
  3. Yazıcı C, Köse K. Melatonin: karanlığın antioksidan gücü. Erciyes Üniversitesi Sağlık Bilimleri Dergisi 2004;13:56-65.
  4. Halliwell B, Gutteridge JMC. Free radicals in biology and medicine 2nd ed. Clarendon Press, Oxford 1996;10-19:86-130.
  5. Valentine JS, Wertz DL, Lyons TJ. The dark side of dioxygen biochemistry. Curr Opin Chem Biol 1998;2:253-262.
  6. Hardeland R, Reiter RJ, Poeggeler B, et al. The significance of the metabolism of the neurohormone melatonin: antioxidative protection and formation of bioactive substances. Neurosci Biobehav Rev 1993;17:347-357.
  7. Brusco LI, Marquez M, Cardinali DP. Monozygotic twins in Alzheimer's disease treated with melatonin: case report. J Pineal Res 1998;25:260–263.
  8. Gitto E, Karbownik M, Reiter RJ. Effects of melatonin treatment in septic newborns. Pediatr Res 2001;50:756–760.
  9. Fulia F, Gitto E, Cuzzocrea S. Increased levels of malondialdehyde and nitrite/nitrate in the blood of asphyxiated newborns. J Pineal Res 2001;31:343-349.
  10. Mogulkoc R, Baltacı A, Öztekin E, et al. Melatonin prevents oxidant damage in various tissues of rats with hyperthyroidism. Life Sci 2006 ;79:311-315
  11. Venditti P, Balestrieri M, Di Meo S, et al. Effect of thyroid state on lipid peroxidation, antioxidant defences, and susceptibility to oxidative stress in rat tissues. J Endocrinol 1997; 155:151-157.
  12. Venditti P, De Rosa R, Di Meo S. Effect of thyroid state on susceptibility to oxidants and swelling of mitochondria from rat tissues. Free Radic Bio Med 2003;35:485-494.
  13. Baydas B, Meral I. Effects of melatonin on lipid peroxidation and anti-oxidant enzyme activity in rats with experimentally induced hyperthyroidism. Clin Exp Pharmacol Physiol 2005;32:541-544.
  14. Fernandez V, Cornejo P, Tapia G, et al. Influence of hyperthyroidism on the activity of liver nitric oxide synthase in the rat . Nitric Oxide 1997;6:463-468.
  15. Bianchi G, Solaroli E, Zaccheroni V, et al. Oxidative stress and anti-oxidant metabolites in patients with hyperthyroidism: effect of treatment. Horm Metab Res 1999;31:620-624.
  16. Abalovich M, Llesuy S, Gutierrez S, et al. Peripheral parameters of oxidative stress in Graves' disease: the effects of methimazole and 131 iodine treatments. Clin Endocrinol. 2003;59:321-327.
  17. Resch U, Helsel G, Tatzber F, et al. Antioxidant status in thyroid dysfunction. Clin Chem Lab Med 2002;40:1132-1134.
  18. Curran RD, Billiard TR, Stuehr DJ, et al. Hepatocytes produce nitrogen oxides from L-arginine in response to inflammatory products of Kupffer cells. J Exp Med 1989;170:1769-1774.
  19. Billiard TR, Curran RD, Stuehr DJ, et al. Evidence that activation of Kupffer cells results in the production of L-arginine metabolites that release cell-associated iron and inhibit hepotocyte protein synthesis. Surgery 1989;106:364-372.
  20. Ignarro LJ. Nitric oxide: biology and pathobiology, Academic Press, San Diego 2000.