Özet
Amaç: Bu deneysel çalışmada mekanik ikterli sıçanlarda oral Candida verilmesinden sonra Candida albicans translokasyonunun araştırılması amaçlandı. Durum Değerlendirmesi: Candida albicans en sık sistemik enfeksiyona sebep olan fungal patojendir. Mekanik ikterli hastalarda en sık ölüm sebebi septik komplikasyonlar ve böbrek yetmezliğidir. Yöntem: Her grupta 10'ar adet Wistar-Albino erkek sıçan olmak üzere 4 grup oluşturuldu. Grup I'deki sıçanlara laparotomi sonrası herhangi bir işlem yapılmaksızın karın duvarı 3/0 prolen ile kapatıldı. Grup II'de grup I'dekine ek olarak sıçanlara işlem sonrası 1. gün orogastrik Candida inokulasyonu gerçekleştirildi. Grup III'de laparotomi sonrası koledok 3/0 ipek ile bağlandı, kesildi ve karın kapatıldı. Grup IV'de koledok diseke edildikten sonra 3/0 ipek ile bağlanarak kesildi ve karın kapatıldı. İşlem sonrası sıçanların biyokimyasal olarak ikterleri bilirubin ölçümleri ile teyit edildi ve 3. gün sıçanlara oral Candida inokulasyonu gerçekleştirildi. Yedinci gün tüm gruplarda patolojik, mikrobiyolojik ve biyokimyasal tetkik için inferior vena kavadan kan örnekleri ve karaciğer hilusundan, mezenter lenf nodu ve çekumdan doku örnekleri alındı. Bulgular: Mikrobiyolojik değerlendirmede Grup IV'de lenf nodunda Candida pozitifliği anlamlı derecede daha fazla idi (p=0.020). Grup II ile karşılaştırıldığında grup IV'de çekumda Candida kolonizasyonu daha fazla miktarlarda tespit edildi. Bu iki grup, grup I ve III ile karşılaştırıldığındı karaciğer, lenf nodu ve çekum pozitifliği istatistiksel olarak anlamlı derecede farklı idi (p<0.001). Grup IV' de karaciğerde patolojik değişiklikler Grup I ve III'e göre anlamlı derecede daha fazla iken (p<0.05), Grup IV' de lenf nodu reaktif değişiklikleri diğer gruplara göre anlamlı derecede daha fazla idi (p<0.01 ve p<0.001). Aynı şekilde Grup IV' de çekumda patolojik değişiklikler Grup I ve III'e göre anlamlı derecede daha fazla olup (p<0.001 ve p<0.05), Grup II'de çekumda patolojik değişiklikler Grup I ile karşılaştırıldığında anlamlı derecede daha fazla olarak bulundu (p<0.01). Sonuç: Mekanik ikterde, ağızdan verilen Candida suşunun intestinal kolonizasyonu ve translokasyonu artmaktadır.
Giriş
Candida albicans dünyada en sık enfeksiyona sebep olan fungal patojendir. Tedavi edilmeyen olgularda sistemik Candidiazise bağlı mortalite %63-85 arasında değişmektedir. Gastrointestinal sistem normal florasının yaklaşık %20'sini oluşturan mikroorganizma olmasına rağmen özellikle immünsüpresse, travma geçirmiş, diabetik, kanser hastaları ve yenidoğanlarda tedaviye dirençli sistemik enfeksiyonlara sebep olmaktadır. Risk faktörleri arasında nötropeni, vasküler kateter uygulaması, geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı, total parenteral beslenme, hemodiyaliz, abdominal cerrahi, yanıklar ve kronik steroid kullanımı sayılabilir[1-5]. Cerrahi kliniklerinde sık rastlanan mekanik ikterli hasta grubunda hücresel immünitenin birçok yönü baskılanmakta, karaciğer retikuloendotelial sistemdeki hücre hasarına bağlı Candidanın fagositozu gerçekleşmemektedir[6]. Bu da oluşabilecek Candida enfeksiyonlarının daha ölümcül seyredeceği anlamına gelmektedir. Mekanik ikterli hastalarda safra akımının kesilmesi ile birlikte intraluminal safra tuzlarının antiendotoksik etkisi ortadan kalkacağından barsak florasındaki değişikliğe bağlı olarak bakterilerin[7-10] ve mantarların intestinal mukozadan translokasyonunun daha sık olacağı öngörülebilir. Mikroorganizmaların, özellikle bakterilerin sistemik yayılım öncesi fazda intestinal mukozadaki kolonizasyon ve translokasyonu literatürde geniş bir şekilde araştırılmıştır[11-14]. Benzer deneysel çalışmalar aynı sıklıkla olmamakla birlikte Candida için de mevcuttur[15]. Özellikle total parenteral beslenen, geniş yanığı mevcut sıçanlarda yapılan deneysel çalışmalarda Candida translokasyonu ortaya konmuştur[16,17]. Mekanik ikterli olgularda Candida translokasyonu konusunda çalışma mevcut değildir. Bu deneysel çalışmanın amacı mekanik ikterli ratlarda Candida albicans translokasyonunu değerlendirmektir.
Materyal ve Metod
Bu deneysel çalışma, İstanbul Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsünde etik kurul onayı alınarak, İstanbul Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Patoloji Anabilim Dalları ile Vakıf Gureba Eğitim Hastanesi Biyokimya bölümlerinin katkıları ile gerçekleştirildi. Tüm sıçanların günlük içme suyuna, oral Candida inokulasyonu yapılmadan 4 gün önce Streptomisin 2 mg/ml ve Gentamisin sülfat 0.1 mg/ml kondu ve sıçanlar sakrifiye edilinceye kadar devam edildi. Amaç sıçanların intestinal floralarını değiştirip Candida kolonizasyonunu kolaylaştırmaktı. Denekler labaratuvar şartlarında, metalik kafeslerde takip edildi. Beslenmeleri standart sıçan yemi ve yukarıda tarif edilen hazırlanmış içme suyu ile sağlandı. Deneyde CSB 2730 (KUEN 1546) Candida albicans suşu kullanıldı. Suşun 37°C sabouraud dekstroz agarda pasajları yapıldıktan sonra Mac Farland yöntemi ile mililitrede 109cfu olacak şekilde hazırlanan Candida suspansiyonları orogastrik beslenme sondaları ile sıçanlara verildi[18]. Her grupta 10'ar adet 250-300 gr ağırlığında Wistar-Albino erkek sıçan olmak üzere 4 grup oluşturuldu. Sıçanlara Ketamin HCL 90 mg/kg intraperitoneal verilerek genel anestezi sağlandı ve karın cildi traş edildikten sonra orta hat laparatomi yapıldı. Grup I'deki sıçanlara karında herhangi bir işlem yapılmaksızın karın duvarı 3/0 prolen ile kapatıldı. Grup II'de grup I'e ek olarak sıçanlara işlem sonrası 1. gün orogastrik Candida inokulasyonu gerçekleştirildi. Grup III'de laparotomi sonrası koledok 3/0 ipek ile bağlandı, kesildi ve karın kapatıldı. Grup IV'de grup III'e ek olarak işlem sonrası sıçanların biyokimyasal olarak ikterleri bilirubin ölçümleri ile teyit edildi ve 3. gün oral Candida inokulasyonu gerçekleştirildi. Tüm sıçanlara 7. gün Ketamin HCL 90 mg/kg intraperitoneal verilerek genel anestezi sağlandı ve orta hat laparotomi uygulandı. Patolojik, mikrobiyolojik ve biyokimyasal tetkik için inferior vena kavadan kan örnekleri ve karaciğer hilusundan, mezenter lenf nodu ve çekumdan doku örnekleri alındı. Deneklerden steril koşullarda alınan karaciğer, lenf nodu ve çekum örnekleri bekletilmeden mikrobiyoloji laboratuarına ulaştırılarak sıvı glikozlu Sabouraud besiyerine aktarıldı. Steril bir cam baget yardımı ile birkaç dakikalık süre boyunca küçük parçalara ayrılan örnekler besiyeri içinde iyice süspanse edildi daha sonra Pedrideki katı glikozlu Sabouraud besiyerine azaltma yöntemi ile ekim yapıldı. 37°C'de inkübasyonu yapılan besiyerlerinden 2-3. günlerde mayalar izole edildi; klamidospor, artrospor, blastospor ve hif yapılarının tanımlanması için mısır unlu jeloze çizgi ekim ve ayrıca germ tüp deneyleri yapıldı. Klamidospor oluşturup, germ tüpü yapan mayalar Candida albicans olarak tanımlandı. Candida koloni oluşumu makroskopik olarak incelendi. Yarı kantitatif olarak yapılan değerlendirmede agardaki üreme miktarları negatif (-) (0 koloni), artı bir (+) (1-10 koloni), artı iki(++) (10-100 koloni), artı üç (+++) (100'den fazla koloni) olarak skorlandı. Çekum, lenf nodu, karaciğerden (KC) alınan doku örnekleri Hematoksilen -Eosin ile boyanarak histopatolojik değerlendirilmeye alındı[19]. Bu dokularda iltihabi inflamasyonun olması patolojik olarak değerlendirdi. KC'de patolojik değişiklikler; yer yer epiteloid histiyositlerden oluşan yapıların, büyüklü küçüklü düzensiz olması çevresinde hafif fibröz doku ve lenfositlerden zengin iltihabi hücre infiltrasyonunun görülmesi KC granülomu olarak kabul edildi. Lenf folikülerinde büyüme, germinatif merkezlerinde genişleme, sinusoidlerde genişleme, histositlerde artış ve dokuda hafif lenfosit artışı izlenmesi lenf nodunda reaktif değişiklikler olarak yorumlandı. Çekumdan alınan kesitlerde mukozanın incelmesi, kriptaların azalması, deforme olması ve bunların bir kısmının epiteli içerisinde lenfositlerin görülmesi kriptit olarak kabul edildi. Verilerin değerlendirilmesinde SPSS for windows 10.0 istatistik paket programı kullanıldı. Karşılaştırmalarda Ki-kare, Fisher exact test, Kruskal Wallis ve Mann Whitney U testleri kullanıldı. P<0.05 anlamlı kabul edildi.
Sonuçlar
Çalışmamızda Grup III ve IV'de tüm sıçanlarda klinik olarak ikter (idrar rengi koyulaşması, sklera ve ciltte sararma) oluştu. Örnekleme için yapılan laparatomilerde mekanik ikter oluşturulmuş sıçanlarda proksimal koledokta kistik genişleme ve karın içi organ serozalarının sarı renge boyandığı tespit edildi. Grup IV'de bir sıçanda karaciğerde makroskopik olarak Candidaya bağlı olduğu düşünülen granulom tespit edildi. Sıçanların takipleri boyunca Candidanın dermatit gibi yüzeyel ya da sepsis benzeri sistemik tutulumuna ait bulgu tespit edilmedi ve intestinal perforasyon, intraabdominal abse oluşumu görülmedi.
Tartışma
Son yıllarda tanı ve tedavi yöntemlerinin gelişmesi, yoğun bakım ünitelerinin artması, malignite ve immunosupresyon ile daha sık karşılaşılması ile fungal enfeksiyonların insidansı artmıştır. Birçok çalışma Candida infeksiyonuna bağlı septik tablonun oluşumu için gastrointestinal sistemi kaynak olarak göstermektedir[20-22]. Barsak mukozasında meydana gelen Candida kolonizasyonu diğer sistemik etkilerin ortaya çıkabilmesi için ön şarttır. Candida translokasyonu ve enfeksiyon gelişimi konakçı ile patojen organizma Candida arasındaki ilişkiye bağlıdır ve burada temel belirleyici faktör konağın immunolojik durumudur. Özellikle yoğun bakım ünitelerinde takip edilen immünsuprese hastalarda translokasyon sonrası sepsis gelişmekte, mortalite, multiorgan yetmezliği nedeni ile olmaktadır[23,24]. İntestinal mukozada bulunan makrofajlar tarafından fagosite edilen mikroorganizmaların mezenter lenf nodu, karaciğer ve sistemik dolaşıma geçişi olarak tanımlanan translokasyon literatürde özellikle bakteriler için çok geniş bir biçimde araştırılmıştır[25-29]. Translokasyonun gerçekleşmesi için en sık ve önemli görülen koşullar gastrointestinal sistem mukoza bütünlüğünün bozulması, lümen içi mikroorganizma sayısının artarak ciddi kolonizasyon meydana gelmesi ve immün yetmezliklerdir. Translokasyon riskini arttıran olaylar, intestinal obstrüksiyon, geniş yanıklar, kemoterapi, geniş spektrumlu antibiotik kullanımı gibi sayıca arttırılabilir etkenlerdir. [30-34] Ayrıca açlık, genel anestezi, anestezi sırasında oluşabilecek hipotansiyon, kateterizasyon, kanama, cerrahi travma bilinen translokasyon nedenleridir. Literatürde intraperitoneal Ketamin uygulanmasının Candida translokasyonuna neden olduğu yönünde bulgular mevcut değildir. Ancak genel olarak değerlendirildiğinde her türlü travma ve invazif işlemin translokasyona yol açacağı göz önünde bulundurulmalıdır. Literatürde Candida translokasyonu ile ilgili çalışmalar bakteriyel translokasyon kadar sık değildir. Normal mikrofloranın elemanı olan Candida fırsatçı bir patojendir. Araştırmacılar tarafından özellikle geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı sonrası gelişen intestinal kandidiyaz vakaları bildirilmiştir[35]. Lösemi, lenfoma gibi hematolojik maligniteler başta olmak üzere, kanser nedeni ile kemoterapi uygulanmış hastalarda ciddi Candida sepsisi gelişmekte ve gastrointestinal sistem translokasyon kaynağı olarak bildirilmektedir[36,37]. Candida translokasyonu için intestinal lümendeki kolonizasyon tek başına translokasyon için çoğu zaman yeterli olmamaktadır. Daha önce belirtilen birçok risk faktörünün aynı hastada birleşmesi halinde Candidanın intestinal kolonizasyonu ve translokasyonunu arttırmaktadır. Mekanik ikterli hastalarda en sık ölüm sebebi septik komplikasyonlar ve böbrek yetmezliğidir[38,39]. Son yıllarda uygulanan gelişmiş cerrahi müdahale teknikleri ve geniş spektrumlu antibiyotik kullanımına rağmen translokasyon ve endotoksemiye bağlı sepsis ve multiorgan yetmezliği mortaliteden sorumlu tutulmaktadır. Deitch ve ark.[8] koledok ligasyonu yapılan sıçanlarda bakteriel translokasyonu araştırmışlar ve kontrol grubunda %5 olan translokasyonu koledok ligasyonu uygulanan sıçanlarda % 33 olarak bulmuşlardır. Candida albicansa karşı immunolojik savunma primer olarak retikuloendotelyal hücreleri oluşturan doku makrofajları ve dolaşımdaki nötrofiller tarafından yapılarak organizmanın intraselüler fagositozu gerçekleştirilmeye çalışılır. Katz ve ark.ları[40] mekanik ikter oluşturulan sıçanlarda intravenöz rad-yoaktif olarak işaretlenmiş Candida albicansı sistemik dolaşıma vererek mikroorganizmanın dolaşımdan temizlenmesini takip etmişlerdir. Normal sıçanlarda eşit oranda karaciğer ve akciğer dokusu tarafından dolaşımdan temizlenen Candidanın mekanik ikterli sıçanlarda karaciğerden çok daha az miktarda temizlendiği ve ağır yükün akciğerlere devredildiğini tespit edilmişler. Koledok bağlandıktan sonra gelişen periduktal inflamasyon ve fibrozun intraparankimal basıncı arttırarak sinusoidlere gelen kan akımının azaltıp mikroorganizmaların dolaşımdan temizlenmesini güçleştirdiği ifade edilmiştir. Bu açıdan bakıldığında mekanik ikter gelişmiş hastalarda Candida enfeksiyonunun daha kolay septik tabloya sebep olabileceği öngörülebilir. Candida albicans gastrointestinal sistemin her bölgesinde kolonize olabilirken maksimum tutulumun çekumda olduğu ifade edilmektedir[18,41,42]. Çalışmamızda çekumdaki maksimum candida kolonizasyonun Grup IV'deki deneklerde saptanması anlamlı bulunmuştur. Bu artış Grup IV'de meydana gelen translokasyon artışıyla parelellik göstermektedir. Meydana gelen bu kolonizasyonun artış sebebini multifaktöryel olarak değerlendirmekteyiz. Barsak lümeninde safra yokluğu ile mikroflorada meydana gelen ve mukoza geçirgenliğini artıran olaylar, mikrofloranın bozulması, mukozal immün hücrelerin fonksiyon bozukluğu kolaylaştırıcı sebepler olarak sayılabilir. Çalışmamızda oral Candida verilmeyen gruplarda (Grup I ve III) çekumda Candida kolonizasyonunu tespit etmedik ve bu durumu beklenen bir sonuç olarak değerlendirdik. Bendel ve ark.[15] Candida kolonizasyonu ve translokasyonunu parenteral antibiotik baskısı altında ve immunosupresyon için deksametazon verdikleri sıçanlarda araştırmışlardır. Bu iki faktörün Candida translokasyonunu arttırdığını göstermişlerdir. Yine Takahashi ve ark.[43] oluşturduğu Candida translokasyon modelinde protein-kalori yetersizliği ile takip edilen sıçanlarda intestinal epitelde keratin ve musinöz tabakalarda incelme oluştuğu ve dışarıdan Candida verilmesi ile uzun dönem devam eden Candida kolonizasyonunun gerçekleştiğini bildirmişlerdir. Yine bu sıçan grubunda siklofosfamid ya da metotraksat gibi ajanlar ile uygulanan kemoterapi sonrası Candida translokasyonu ve kandideminin arttığı gözlenmiştir. Meis ve ark.[44] HIV(-), kemoterapi nedeni ile immunosupresyona girmiş kemik iliği nakilli hastalarda kandidemi sıklığının arttığını bildirmişlerdir. Çalışmamızda intestinal bariyeri geçtikten sonra mikroorganizmanın ilk olarak mezenterik lenf nodları aracılığı ile karaciğere ulaştığını kabul ettik. Nitekim Grup II ve IV'de Candida inokulasyonu sonrası karaciğerde granulom oluşumu tespit edildi. Grup IV'de bir sıçanda bu tutulum makroskopik olarak da izlendi. Birçok çalışma karaciğer tutulumunun Candida enfeksiyonlarında önemini gündeme getirmiştir. Ishii ve ark.[45] lösemi nedeni ile tedavi gören hastalarında Candida nedeni ile multipl karaciğer absesi gelişmesi üzerine abse tedavisine Amfoterisin B nin perkutan transhepatik portal vene uygulanması ile başarılı tedaviye ulaşmışlardır. Candidanın ilk translokasyon basamağı olarak mezenterik lenf nodlarını kullandığı bilinmektedir. Çalışmamızda oral Candida verilen denek lenf nodlarının birçoğunda reaktif değişiklikler tespit edildi. Bu değişikliklerin intestinal mukozada Candida kolonizasyonuna sekonder mi yoksa non-spesifik değişiklikler mi olduğunu net ortaya koyamadık. Lenf nodlarında histopatolojik olarak Candida invazyonu gösterilememiştir. Biz bu durumu Candidanın lenf nodlarına geçtiğini fakat burada ciddi bir invazyon yaratmadan karaciğer ve diğer organlara transloke olduğu şeklinde açıkladık. Çünkü Candidanın dokuda mikrobiyolojik olarak varlığı mevcutken ciddi granulamatoz reaksiyon ya da invazyon yapmayabileceği bilinmektedir. Çalışmamızın ortaya koyduğu ilginç sonuçlardan biri de grup II'de oral Candida verilmesini takiben oluşan kolonizasyon az miktarda olmakla beraber, %20 oranında görülen karaciğere yayılımdır. Bu açıdan herhangi bir risk faktörü olmaksızın gerekli kolonizasyon ortamı gerçekleştiğinde normal populasyonda bile Candida translokasyonu olabileceği düşünülebilir. Literatürde prematür yenidoğanlarda spontan, sağlıklı erişkinlerde sadece geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı sonrası intraabdominal kandidiyaz olguları bildirilmiştir[46]. Bu nedenle gizli seyir gösteren, uzun süre geniş spektrumlu antibiotik kullanmış hastalarda intraabdominal abse ayırıcı tanısında Candidal abse hatırlanması gereken bir patoloji olmalıdır. Oral Candida inokulasyonu yapılan gruplar dahil olmak üzere hiçbir grupta kan kültürlerinde Candida üremesi tesbit edilmedi. Ayrıca sıçanların sakrifikasyonuna dek septik tablo gelişen sıçan olmamıştır. Karaciğer tutulumu sonrasında sepsis ya da kandidemi beklenen sonuçlardır. Biz sıçanları oral Candida verilmesinden 7 gün sonra sakrifiye ettik. Bu açıdan bakıldığında kandidemi gelişmemesini sıçanların erken evrede kandidemi gelişmeden sakrifiye ederek çalışmanın bitirilmesi ile açıklıyoruz. Sepsis tablosunda parametre olarak kullandığımız bir akut faz reaktanı olan CRP değerleri tüm sıçanlarda normal seviyelerde tespit edilmiştir. Bu sonuç mikrobiyolojik olarak tespit edemediğimiz sepsis ve kandideminin biyokimyasal olarak onaylanması biçiminde yorumlanabilir. Sonuç olarak, ağızdan verilen Candida suşunun ikterli ratlarda intestinal kolonizasyonu ve translokasyonu artmaktadır.
