Özet
Amaç: İntestinal obstrüksiyon; normal ekolojik dengenin bozulmasına yol açarak pro-inflamatuvar ve inflamatuvar sitokinlerin sekresyonunda artış, oksidatif hasar, mukozal bariyer disfonksiyonu ve bakteriyel translokasyon ile sonuçlanır. Splenektomi sonucu ortaya çıkan mitojenik aktivitenin T hücre proliferasyonunu arttırarak serumda tufsin seviyesinin azalmasına yol açtığı ve bunun sonucunda translokasyon gelişimini etkilediği iddia edilmektedir. Bu çalışmada splenektominin ratlarda intestinal obstrüksiyona bağlı ortaya çıkan bakteriyel translokasyon ve inflamatuvar yanıt değişiklikleri üzerine etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Yirmi dört adet rat 3 gruba ayrıldı: Grup 1 (Sham), yalnızca ileoçekal bileşke diseksiyonu; Grup 2 (İntestinal obstrüksiyon), komplet (tam) ileal ligasyon; Grup 3 (Splenektomi+intestinal obstrüksiyon), splenektomi ve sonrasında komplet ileal ligasyon. Ratlar ilk laparotomiyi takiben, 24 saat sonra intrakardiyak bölgeden kan alınarak sakrifiye edildi. Steril koşullarda alınan periton sürüntüsü, mezenterik lenf nodu, karaciğer ve ileal doku örnekleri mikrobiyolojik, biyokimyasal ve histopatolojik olarak incelendi. Bulgular: İntestinal obstrüksiyon sonrası bakteriyel translokasyon, oksidatif stres, inflamasyon ve ileal mukoza hasarının belirgin olarak arttığı gözlendi (p<0.05). İntestinal obstrüksiyon sonrası splenektomize ratlar ile splenektomi uygulanmayan ratlar arasında bir farklılık izlenmedi. Asimetrik dimetilarjinin değerleri açısından tüm gruplar benzerdi (p>0.05) Sonuç: Çalışmamızda splenektominin ratlarda deneysel olarak oluşturulan barsak tıkanma modelinde bakteriyel translokasyon ve inflamasyon üzerine anlamlı bir etkisi görülmemiştir.
Giriş
İnce barsakların sindirim ve absorbsiyon yanında en önemli görevi; antijenler, toksinler ve mikroorganizmalar için fonksiyonel ve mekanik bir bariyer oluşturmasıdır[1]. İnce barsaklarda çok az bakteri mevcuttur, ancak intestinal obstrüksiyon (İO) sonrası normal ekolojik denge bozulur[2]. Normal ekolojik dengenin bozulması ise, proinflamatuvar ve inflamatuvar sitokinlerin sekresyonunda artış, oksidatif hasar, mukozal bariyer disfonksiyonu ve bakteriyel translokasyon (BT) ile sonuçlanır[1]. Artmış intestinal geçirgenlik; normalde steril olan peritoneal alan, mezenterik lenf nodları, karaciğer, dalak ve sistemik dolaşıma bakteri ve ürünlerinin translokasyonunu artırarak sistemik inflamatuvar cevabın ortaya çıkmasına neden olur[2]. İnterlökin-6 (IL-6), interlökin–1 beta (IL-1β) ve tümör nekroz faktörü-alpha (TNF-α) oksidatif stres ve inflamasyon sonrası indüklenen önemli pro-inflamatuvar sitokinlerdir. C-reaktif protein (CRP); akut faz reaktanı olup sistemik inflamatuvar yanıtın da önemli bir belirtecidir[3]. Asimetrik dimetilarjinin (ADMA) endojen nitrik asit sentaz inhibitörü olup, son zamanlara multipl organ yetmezliği ve yoğun bakım ölümlerinin tespitinde önemli bir parametre olarak bildirilmiştir[4]. Dalak, diğer organlardaki immün hücrelerin regülasyonunu düzenleyebilecek mediatörler oluşturabilmektedir. Splenektominin immün hücre popülasyonları üzerine olan bu etkisinin ortadan kalkması sonucu ortaya çıkan mitojenik aktivite T hücre proliferasyonunun artmasına ve serumda tufsinin seviyesinin azalmasına yol açar[5]. Biyomateryallere karşı makrofaj cevabında gecikme ve biyoaktif mediatörlerin salınmasında azalma meydana gelir. Ortaya çıkan bu değişikliklerin ince bağırsaklarda BT gelişimini azaltabileceği bildirilmektedir[6,7]. Bu çalışmada splenektominin ratlarda mekanik İO sonrası ortaya çıkan BT ve inflamatuvar yanıt değişikliklerinin etkisinin mikrobiyolojik, biyokimyasal ve histopatolojik olarak araştırılması amaçlanmıştır.
Materyal ve Metod
Bu çalışma Hayvan Deneyleri Yerel Etik kurulunca etik yönden uygun bulunarak ‘Guidelines in the use and care of laboratory animals’ kuralları çerçevesinde yapılmıştır[8]. Deney Hayvanları Ağırlıkları 200-280 gram arasında değişen 24 adet W istar Albino rat çalışmaya alındı. Tüm ratlar kafeslerde 12 saat gece 12 saat gündüz olmak üzere 20–26°C sıcaklık olacak şekilde tutularak standart rat yemi ve musluk suyuyla beslendi. Deneysel Çalışma Akşamdan aç bırakılan hayvanlara intramuskuler yoldan 50 mg/kg Ketamin hidroklorür (Ketalar®; Parke Davis, Pfizer, İstanbul, Türkiye) ve 10 mg/kg Xylazine (Rompun®; Bayer AG, Leverkusen, Germany) enjekte edilerek anestezi sağlandı. Toraks ve karın traşını takiben %10’luk povidon iyodin solüsyonu (Betadine ®) ile cilt temizliği yapıldı. Steril koşullarda ratlara 4 cm’lik orta hat insizyonu ile laparotomi uygulandı. Çekumun yaklaşık 1 cm proksimalinden ileum 4.0 serbest ipek sutür ile nekroz oluşturmayacak ancak pasajı engelleyecek şekilde bağlanarak mekanik ince barsak obstrüksiyonu oluşturuldu. Dalak serbestleştirildikten sonra pedikülü 4/0 ipek ile bağlandı. Pankreasın korunmasına özen gösterilerek splenektomi gerçekleştirildi. Peritoneal alana 2 ml serum fizyolojik verilerek insizyon çift kat olarak kapatıldı. 24 saat sonra yeniden intramuskuler yoldan 50 mg/kg Ketamin hidroklorür ve 10 mg/kg Xylazine enjekte edilerek anestezi sağlandı ve %10’luk povidon iyodin solüsyonu ile cilt temizliği yapılarak steril koşullarda intrakardiyak kan alınarak ratlar sakrifiye edildi. Daha sonra torako-abdominal insizyon ile karın tekrar açılarak intraperitoneal alandan sürüntü yoluyla kültür alındıktan sonra, mezenterik lenf nodları ve karaciğer doku örnekleri mikrobiyolojik ve histopatolojik inceleme için alındı. Ligasyon uygulanan segmentin proksimalinden yaklaşık 5 cm’lik ileal segment ileal mukozal bütünlük, ödem ve inflamasyon açısından histopatolojik değerlendirilme için rezeke edildi. Deney Grupları Çalışmaya her grupta 8 adet olacak şekilde toplam 24 adet Wistar Albino dişi rat alındı. Grup I (Sham, S); Laparatomi uygulanarak ileoçekal bileşke ortaya konuldu ve herhangi bir işlem yapmadan peritoneal alana 2 ml serum fizyolojik verilerek insizyon kapatıldı. Grup II (İntestinal obstrüksiyon, İO); Laparotomi sonrası ileoçekal bileşke ortaya konuldu ve çekumun 1 cm proksimalinden ileum 4/0 ipek sutür ile nekroz oluşturmayacak ancak pasajı engelleyecek şekilde bağlanarak mekanik İO oluşturuldu. Peritoneal alana 2 ml serum fizyolojik verilerek insizyon kapatıldı. Grup III (Splenektomi + intestinal obstrüksiyon, SP+İO); Laparatomi sonrası splenektomi uygulandı. Takiben ileoçekal bileşke ortaya kondu ve çekumun 1 cm proksimalinden ileum 4/0 ipek sutür ile nekroz oluşturmayacak ancak pasajı engelleyecek şekilde bağlanarak mekanik İO oluşturuldu. Peritoneal alana 2 ml serum fizyolojik verilerek insizyon kapatıldı. Mikrobiyolojik İnceleme Peritoneal sürüntü, mezenterik lenf nodları ve karaciğer doku örnekleri ve kan örnekleri mikrobiyolojik inceleme için alındı. Ratlara steril bir şekilde laparotomi yapılarak ilk olarak her bir hayvandan 1 ml kan örneği alınarak Brain heart infüzyon (BHI) besiyeri içeren bifazik kan kültürü vasatlarına inoküle edile rek ve aerob ortamda 37 ºC de inkübasyona bırakıldı. Luminal içeriği steril izotonik serum fizyolojik içinde homojenize edilerek McConkay ve kanlı agara ekim yapıldı. Peritoneal sürüntü örneği ile McConkay ve kanlı agara ekim yapıldı. Ardından mezenter lenf nodu, karaciğer doku biyopsi örnekleri alınarak steril cam homojenizatörlerde 2 ml BHI besiyeri içerisinde homojenize edildi. Homojenize edilen doku örneklerinden 0.1 ml alınarak kanlı agar ve McConcay agara inoküle edildi. Tüm besiyerleri 37°C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılarak bakterilerin üremesi gözlemlendi. Üreme olan kültürlerdeki bakterilerin identifikasyonları standart mikrobiyolojik yöntemler ve gram boyama ile yapıldı. Biyokimyasal Analizler Total oksidan aktivite (TOA), total antioksidan status (TAS), paroxanase (PONX), TNF-α, IL-6, IL-1β, CRP ve ADMA analizleri kan örneklerinde gerçekleştirildi. Her grupta deneysel işlemlerin sonunda, intrakardiyak yolla alınan kanın 1 ml’si mikrobiyolojik inceleme için ayrıldıktan sonra süratle santrifüjlenerek elde edilen numune biyokimyasal analizler için plastik ependorf kapaklı tüplere transfer edilerek -80 ºC derin dondurucuda saklandı. İnflamatuvar cevabın göstergesi olarak TNF-α, IL-1β, IL-6 gibi biyokimyasal parametrelerin analitik uygulama, hesaplama ve birim dönüşümleri gerçekleştirildi. CRP ölçümü nefelometrik olarak ölçüldü. TNF-α, IL-1β, IL-6 ve ADMA serum düzeyi ticari kemilüminesan immun assay kitleri kullanılarak ölçüldü. TOA düzeyleri Erel tarafından gerçekleştirilen yöntemle ölçüldü ve değerler μmol H2O2 Eq/L olarak verildi[9] Serum TAS seviyeleri Erel yöntemiyle değerlendirildi ve sonuçlar mmol Trolox Eq./L olarak verildi[10]. Serum PONX seviyeleri modifiye Eckerson yöntemi ile spektrofotometrik olarak ölçüldü[10] ve sonuçlar U/L olarak verildi[11]. Patolojik Değerlendirme İleal segmentler mukozal hasar skoru açısından incelendi. İleal segment, mezenterik lenf nodları ve karaciğer örnekleri inflamatuvar hücre infiltrasyonu derecesi açısından değerlendirildi. Ratlardan alınan doku örnekleri %10’luk formaldehid solüsyonu içerisine konulup 24 saat tesbit yapıldıktan sonra rutin histolojik doku takibinden geçirilerek parafin bloklara yerleştirildi ve mikrotom yardımıyla 4-5 μm’lik kesitler hazırlandı. Elde edilen doku kesitleri hematoksilen-eozin (H&E) ile boyanarak standart protokol uygulandı. Hazırlanan preparatlar belirli uzman bir patolog tarafından ışık mikroskobu (Nikon ECLIPSE 80i) altında ileal doku örneklerinde mukozal inflamasyon ve ödem bulguları, mezenterik lenf nodlarında ve karaciğer örneklerinde parankimal inflamasyon ve ödem bulguları değerlendirildi. Mukozal hasar ve inflamatuvar değişiklikler yönünden bulgular; değişiklik yok (0), hafif derecede değişiklikler (1), orta derecede değişiklikler (2) ve belirgin değişiklikler (3) olmak üzere skorlanarak kaydedildi (2). İstatistiksel Değerlendirme Çalışmada elde edilen bulgular değerlendirilirken, istatistiksel analizler için SPSS (Statistical Package for Social Sciences) for Windows 11.5 programı kullanıldı. Çalışma verileri ortalama±standart sapma olarak sunuldu ve tanımlayıcı istatistikler yapıldı. Nitel verilerin karşılaştırılmasında ki-kare testi kullanıldı. Grupların karşılaştırmalarında Kruskal Wallis testi kullanıldı. Anlamlı farklılık tespit edilen parametrelerde ikili grup karşılaştırmalarında Mann Whitney U testi kullanıldı. İstatistiksel olarak p<0.05 değeri anlamlı kabul edildi.
Sonuçlar
Deneysel çalışma esnasında ratlarda mortalite gelişmedi. Mikrobiyolojik sonuçlar Gruplara ait kültür sonuçları Tablo 1’de pozitif kültür/toplam rat sayısı şeklinde sunuldu. Gruplar karşılaştırıldığında kan, karaciğer, mezenterik lenf nodu ve periton kültürlerinde üreme açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılık izlendi. İO grubunda kan (p=0.01), karaciğer (p=0.002), mezenter (p=0.038) ve periton (p=0.038) kültürlerinde S grubuna göre anlamlı farklılık izlendi. SP+İO grubunda İO grubuna oranla pozitif kültür sayıları daha az olmasına rağmen, istatistiksel olarak anlamlı fark izlenmedi. Biyokimyasal sonuçlar Gruplara ait biyokimyasal sonuçlar Tablo 2’de gösterildi. Gruplar karşılaştırıldığında PONX, TOA, TNF-α, IL-6, IL-1β ve CRP açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılık izlendi. Anlamlı farklılık olan parametrelerde gruplar ikili olarak karşılaştırıldığında; İO sonrası oksidatif stresin belirgin olarak arttığı gözlendi. S grubunda her iki gruba oranla TOA değerleri anlamlı olarak daha düşük, PONX değerleri ise daha yüksek olarak saptandı. TAS değerleri açısından anlamlı farklılık izlenmedi. Splenektomi yapılan ve yapılmayan grupta İO sonrası oksidan ve antioksidan parametreler benzer olarak saptandı (p>0.05). Tüm antiinflamatuvar sitokinler (TNF-α, IL-6, IL-1β) ve CRP düzeylerinde İO sonrası belirgin olarak artış saptandı. İO ve SP+İO grupları karşılaştırıldığında ise antiinflamatuvar sit o kin ve CRP düzeyleri açısından farklılık izlenmedi (p>0.05). Serum ADMA düzeyleri açısından tüm gruplar arasındaki farklılıkl ar istatistiksel olarak anlamlı değildi. Patolojik sonuçlar Gruplara ait patolojik sonuçlar Tablo 3’te gösterildi. Gruplar karşılaştırıldığında karaciğer ve ince barsak inflamasyon derecesi ve ince barsak mukozal hasarı açısından anlamlı farklılık izlendi. S ve İO grubu karşılaştırıldığında hepatik (p=0.028) ve ileal (p=0.005) inflamasyon skorları ile ileal mukoza hasar skoru (p=0.01), İO grubunda belirgin olarak daha yüksek bulundu. SP+İO grubunda ise değerlerin İO grubuna oranla ılımlı olarak daha düşük olduğu, ancak aradaki farklılığın anlamlı olmadığı saptandı (Resim 1).
Tartışma
Acil cerrahi hastalıkların yaklaşık % 20’sini oluşturan İO, cerrahlar için hala önemli bir sorun olmaya devam etmektedir[12]. İO sonucu bakterilerin aşırı üremesi nedeniyle artan bakteriyel proteazların spesifik mikrovillus membran proteinlerine etkisinin bir sonucu olarak besin malabsorbsiyonu ile monosakkarit transportunda bozulma meydana gelir. Bakteri veya ürünlerinin etkisi ile fırçamsı yü zeyel aktivitede meydana gelen kayıp BT gelişimine yol açar[13]. BT oluşumunu kolaylaştıran faktörler; iyonize radyasyon, endotoksinler, travma, nutrisyonel stres, peritoneal inflamasyon, böbrek yetmezliği, mikroflora değişiklikleri, obstrüksiyon, hemorajik şok, hücresel immünite bozuklukları, IgA defektleri, fagositik hücre defektleri, total parenteral beslenme, antibiyotikler ve immünsupresyon şeklinde sıralanabilir[14,15]. BT sonucu barsak duvarını geçen enterik bakterilerin 24–48 saat içinde lenfatiksistemik veya portal-sistemik yol ile sistemik dolaşıma geçtiği düşünülmektedir[<16>-18]. BT sonucu dokulardan en sık izole edilen mikroorganizma Escherichia coli’dir [2]. Çalışmamızda da en sık kültürlerde saptanan mikroorganizma Escherichia coli idi. Dalak enfeksiyona karşı defansta önemli rol oynamaktadır. Klinik olarak asplenik hastalarda dalağın filtre fonksiyonunun kaybına bağlı olarak enkapsüle mikroorganizmalarla letal sepsise duyarlılık artar[19,20]. Ayrıca splenektomi sonrası BT gelişimine karşı defans mekanizmalarında önemli bir rol oynayan Kuppfer hücrelerinin sayısının arttığı bildirilmiştir[19]. Spaeth ve ark.[21] endotoksin kullanarak oluşturulan İO modelinde splenektominin BT gelişimini azalttığını bildirmişlerdir. Baykal ve ark.[19] ise, splenektomi yapılan yanık modelinde BT gelişimini araştırmış; yanık oluşturulmayan grupta splenektomi veya parsiyel splenektominin tek başına BT gelişimine yol açmadığını, yanık oluşturulan grupta ise splenektominin BT gelişimini anlamlı olarak azalttığını bildirmiş ve bunun splenektominin BT gelişimini engelleyen defans mekanizmaları üzerine düzenleyici etkilerine bağlı olabileceğini bildirmişlerdir. Sarı ve ark.[22] da yaptıkları çalışmada splenektominin major travma sonrası BT gelişimine karşı koruyucu etkileri olduğunu ve deneysel travma modelinde hepatik rejenerasyonu da artırdığını bildirmişlerdir. Çalışmamızda ise İO sonrası BT gelişimi üzerine splenektominin negatif ya da pozitif herhangi bir etkisinin olmadığı görüldü. TNF-α, multipl organ disfonksiyonu (MOD) ve sistemik inflamatuvar reaksiyon sendromunda önemli bir mediatör olarak bilinmektedir. Klinikte serumda yüksek seviyelerde bulunması muhtemelen enfeksiyon lehine yorumlanmaktadır[23]. Deneysel çalışmalarda; intravenöz olarak verilen endotoksin ve canlı bakteriler TNF-α düzeylerini artırmaktadır[24]. Lokalize yaralanmalarda da dolaşımda artan miktarlarda sitokinler, TNF-α ve IL-6 saptanmıştır[25]. İO sonrası endotoksinlerin absorbsiyonu TNF-α seviyelerinde artışa yol açar. TNF-α sekresyonunda artış ise intestinal ve vasküler endotelyum üzerinde nekrotizan etkilerin meydana gelmesine neden olur. IL-1β ve IL-6 gibi sitokinler, proinflamatuvar ve inflamatuvar değişikliklerin oluşmasına ve patojenlerin eliminasyonunu sağlayan hızlı bağışıklık yanıtın ortaya çıkmasına yol açar[26]. CRP klasik bir akut faz reaktanı olup; enfeksiyon, iskemi, travma, yanık ve inflamatuvar olaylarda 1000 katına kadar çıkabilmektedir. CRP doku yaralanması veya inflamasyonun şiddetinin bir göstergesi olup paralel olarak yükselir[27]. Çevikel ve ark.[3], İO sonrası gelişen BT ile ilgili çalışmasında, CRP düzeylerinin BT şiddeti ile ilişkili olduğu ve İO sonrası BT şiddetinin monitorizasyonunda faydalı olabileceğini bildirmektedirler. Çalışmamızda ise İO sonrası inflamatuvar sitokinlerin ve CRP seviyelerinin belirgin olarak arttığı, bu nedenle BT gelişiminin monitorizasyonunda birer parametre olarak kullanılabilecekleri saptandı. Ancak İO sonra ortaya çıkan inflamatuvar yanıtın ve CRP düzeylerinin splenektomili olanlarda farklı olmadığı görüldü. MOD, karaciğer yetmezliği ve yoğun bakım ölümlerine konsantrasyon bağımlı olarak ilişkili olduğu bildirilen ADMA düzeyleri, MOD gelişiminin yeni ve önemli bir göstergesidir[4]. Çalışmamızda ADMA düzeylerinin benzer şekilde BT gelişiminde bir belirteç olup olmadığı araştırıldı. Ancak İO sonrası sham grubuna oranla ADMA düzeylerinde anlamlı bir farklılık saptanmadı. Bu nedenle, ADMA’nın bir prognostik belirteç olarak BT gelişiminde kullanım için uygun bir parametre olmadığı saptandı. PONX peroksidatif hasara karşı antioksidan özelliklere sahip bir glikoproteindir[28]. Ayrıca yapılan çalışmalarda TAS ve TOA değerlerinin ölçümünün oksidan ve antioksidan parametrelerin değerlendirilmesinde faydalı oldukları tespit edilmiştir[29]. Çalışmamızda İO sonrası PONX değerlerinin azaldığı, TOA değerlerinin ise arttığı ve bu değişikliklerin istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptandı. TAS değerlerinde ise anlamlı farklılık saptanmadı. Bu bulgu İO sonrası oksidatif stresin arttığı ve bu artışa paralel şekilde antioksidan mekanizmalar ile oluşturulan yanıtın yeterli olmadığı şeklinde yorumlanabilir. SP+İO ve İO grubunun sonuçlarının benzer olması, splenektominin bu mekanizmalar üzerine anlamlı bir etkisi olmadığı şeklinde yorumlanabilir. İO sonrası artan lümen içi basınç kapiller hidrostatik basıncın yükselmesine, dokuda ödemin daha fazla artmasına ve arteriyel kan akımının da etkilenmesine neden olur[30]. İO fizyopatolojisinde, intestinal dokuda ortaya çıkan inflamasyon önemli rol oynamaktadır[31]. Akçay ve ark.[17], İO sonrası ince barsak dokusunda iltihabi infiltrasyon, ödem ve hipereminin anlamlı olarak arttığını, intestinal villus yapılarının bozulduğu ve boylarının da kısaldığını bildirmiştir. Ayrıca, basit İO sonrası sadece barsakta ödem gözlenirken, strangülasyon gelişenlerde ödem, kanama ve nekroz saptandığı bildirilmektedir[32]. Çalışmamızda İO sonrası ileal değişiklikler yanında, hepatik inflamasyon ve mezenterik lenf nodülü çaplarında değişiklikler araştırıldı. İO sonrası hepatik ve ileal inflamasyonda belirgin artış ve ileal mukozada subtotal villus atrofisi, şiddetli ödem ve inflamasyonun eşlik ettiği ılımlı dejeneratif epitelyal değişiklikler olduğu, bu değişikliklerin istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptandı. SP+İO ve İO grubu karşılaştırıldığında, splenektomi yapılan ratlarda da sonuçların benzer olduğu görüldü. Bu çalışmanının kısıtlayıcı yönü kullanılan rat sayısının az olmasıdır. Bu nedenle daha fazla rat veya deneklerin kullanılabileceği geniş çalışmaların yapılması uygun olacaktır.
Sonuç
İO sonucu artan inflamatuvar sitokinler ve oksidatif stres; intestinal mukozal hasar ve BT gelişimini artırmakta, ince bağırsak ve karaciğerde inflamatuvar değişikliklerin oluşmasına yol açmaktadır. Çalışmamızda; İO sonrası ortaya çıkan bakteriyel translokasyon ve inflamatuvar değişiklikler splenektomize ratlarda daha az görülmesine rağmen, splenektomili ve splenektomili olmayan ratlar arasında istatistiksel olarak anlamlı değişiklikler saptanmadı. Bu nedenle İO sonrası ortaya çıkan bakteriyel translokasyon ve inflamatuvar değişikliklerin düzenlenmesinde dalağın anlamlı bir fonksiyonu olmadığını düşünmekteyiz.
