Özet
Amaç: Sıçanlarda random deri fleplerine β-Glukanın etkisini ve distal nekrozu azaltabilme özelliğini göstermektir. Gereç ve Yöntem: Çalışmaya 14 adet erişkin dişi Wistar sıçan alındı ve her bir grupta 7 denek olacak Şekilde randomize 2 grup oluşturuldu. A grubu kontrol grubu, B grubu operasyondan 5 gün önce başlanıp her gün, operasyon günü ve takip eden 2 güne kadar sadece 200 mg/kg β-Glukan peroral verilen grubu oluşturdu. Sıçanların sırtından 2x7 cm boyutunda tam kat deri flebi pedikülü sıçanın kuyruk bölgesinde kalacak Şekilde kaldırıldı. Postoperatif 7. gün distal nekroz oranları saptandı. Flep uç kısmından (pediküle doğru) itibaren 2. ve 5. cm'den 1 cm2 boyutunda tam kat deri alanı malondialdehit değerlendirmesi ve histopatolojik değerlendirme için alındı. Bulgular: Kontrol grubunda ortalama nekroz alanı boyutu 3.91±1.38 cm2 iken, β-Glukan grubunda ortalama 1.13±0.88 cm2 olarak saptandı (p<0.001). Doku örneklerinde malondialdehit değerleri β-Glukan grubunda kontrol grubuna göre daha düşüktü (Kontrol grubunun 2. cm'sinde ortalama 2.5±1.13, 5. cm'sinde ortalama 2.7±2.19 nmol/g doku iken, β-Glukan grubunun 2. cm'sinde ortalama 0.9±0.56, 5. cm'sinde ortalama 1.2±1.07 nmol/g doku idi, 2. ve 5. cm, sırasıyla p<0.02, p=0.123). Histopatolojik olarak β-Glukan grubunda makrofaj ve fibroblast aktivitesinde önemli artış saptandı. Histopatolojik değerlendirme β-Glukanın koruyucu etkisini göstermektedir. β-Glukan ile tedavi edilmiş sıçanlarda deri flep nekrozunun tedavi edilmemişlere göre daha az olduğu görülmüştür. Sonuç: Bu çalışma random deri flep canlılığı için β-Glukanın önemini göstermektedir.
Giriş
Flep cerrahisi sonrası dokularda görülen nekroz günümüzde en önemli problemlerden biri olmaya devam etmektedir. Bu problemi çözmeye yönelik birçok medikal ve cerrahi çalışma halen devam etmektedir [1,2]. Random iskemik deri fleplerinde nekroza; venöz dönüş eksikliği, iskemi ve oksijenin neden olduğu bilinmektedir. Bu bilgi çerçevesinde deneysel çalışmalar yapılmış ve sempatolitikler, vazodilatatörler, antikoagülanlar, prostoglandin inhibitörleri, serbest oksijen radikal tutucuları gibi birçok farmakolojik ajan flebi iskemiye karşı korumak için kullanılmıştır [3,4]. Deneysel olarak bazı ajanların faydaları saptanmış fakat klinik pratikte bu ajanların kullanımı ile ilgili belirli fikir birliğine varılamamıştır. Glukan Saccharomyces cerevisiae‘nın duvarından izole edilen doğal polisakkarid yapısında bir maddedir [5]. b-1.3 glukan oral yoldan etkili nontoksik güçlü bir immünostimülandır. 1980'li yılların sonlarında bu materyalin makrofajların yüzeyinde var olan spesifik reseptörlere etki ettiği tanımlanmış, makrofajların β glukan reseptörleri olduğu ve bu reseptörlere bağlanmanın makrofaj aktivasyonuna yol açtığı bildirilmiştir [6,8]. Sıçanlarda yürütülen deneysel çalışmalar glukan uygulamasının granülosit ve makrofaj üretimini arttırdığını düşündürmektedir. β-Glukanın antibakteriyal, antifungal, antiviral, antitümöral, antienflamatuar etkileri ve makrofaj aktivasyonuna etkileri bildirilmiştir [9,13]. Bu bilgilerin ışığında yapılan korele invivo çalışmalarda glukanın major torasik ve gastrointestinal cerrahi girişimler sonrası immün sistemi güçlendirdiği, malnütrisyonu önlediği, makrofaj ve lökosit fonksiyonlarını iyileştirerek ciddi yara yeri enfeksiyonlarını ve ölümü rölatif olarak azalttığını belirtmişlerdir [14,19]. Ayrıca glukan etkili bir serbest oksijen radikali temizleyicisi olarak antioksidan özellik de gösterir [20]. Sıçanlarda yapılan cilt yara modelleriyle, glukan uygulanmasının artmış yara gerilim direncini yükselttiği ve yara yeri iyileşmesinin daha iyi olduğu gösterilmiştir [21,24]. İnsan deri fibroblastlarında ve murine yara modelinde kollajen biyosentezini uyardığı saptanmıştır [25,26]. Bu çalışmanın hipotezi β-Glukanın immünostimülan, antibakteriyal, antifungal, antiviral, antitümöral, antienflamatuar ve makrofaj aktivasyonuna etkileri ile deri flep canlılığı arasında ilişki olabileceği olup, çalışmanın amacı β-Glukanın yara iyileşmesi üzerine olan olumlu etkileri göz önüne alınarak sıçan modelinde glukan uygulamasının, deri fleplerinin sağ kalımına etkisini belirlemektir.
Materyal ve Metod
Bu çalışma Dr. Abdurrahman Yurtarslan Ankara Onkoloji Eğitim ve Araştırma Hastanesi Eğitim Planlama ve Koordinasyon Kurulu'nun onayı alınarak, “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” kriterleri göz önüne alınarak gerçekleştirildi. Çalışmaya ağırlıkları 200-250 gr. arasında olan 14 adet erişkin dişi Wistar sıçan alındı ve her bir grupta 7 denek olacak Şekilde randomize 2 grup oluşturuldu. A grubu kontrol grubu, B grubu operasyondan 5 gün önce başlanıp her gün, operasyon günü ve takip eden 2 güne kadar sadece 200 mg/kg Glukan peroral verilen grubu oluşturdu (Glukan grubu). Operasyon öncesi bütün sıçanlara 50 mg/kg ketamin hidroklorür ve 10 mg/kg xylazin anestezik amaçlı uygulandı. Sıçanların sırtları derileri sağlam kalacak şekilde traş edildi. Sıçanların sırtından 2x7 cm boyutunda tam kat deri flebi pedikülü sıçanın kuyruk bölgesinde kalacak Şekilde standart Mc-Farlane tipi dorsal fare flep modelinde kaldırıldı [27]. Hemostazı takiben deri flebi kaldırıldığı alana cilt cilde 4/0 prolenle sütüre edildi. Ameliyattan sonra sıçanların yiyeceği ve su içmeleri serbest bırakıldı. Postoperatif 7. günde sıçanların sırtlarındaki flep alanlarında oluşan nekroz alanları ölçüldü. Flep alanlarının 2. ve 5. cm'lerinden tam kat 1 cm2'lik doku örnekleri alındı. Dokular patolojik değerlendirme ve biyokimyasal analiz için iki eşit parçaya bölündü. Histopatolojik değerlendirme için alınan dokular nekroz alanlarını ve polimorfnüveli lökosit (PMNL) aktivasyonunun değerlendirilmesi için %10'luk formaldehide konuldu. Diğer yarısı hidroksiprolin ve malonildialdehit (MDA) değerlendirmesi için alüminyum folyoya sarılarak sıvı azot tankına konuldu. MDA tayini, Mihara ve Uchiyama tarafından geliştirilen metot ile çalışıldı [28]. Numuneden 0.5 mL alınarak, 3 mL fosforik asit, 1 mL tiyobarbitürik asit (TBA) solüsyonuna ilave edildi. Kaynar su banyosunda 45 dakika bekletilip soğutulan tüplere 4 mL n-butanol ilave edilip karıştırıldı. 2500 rpm'de 5 dakika santrifüj edildikten sonra tüpün üst kısmındaki n-butanol fazı 535 ve 520 nm'de spektrofotometrede okutuldu. İki absorbans arasındaki fark nmol/g doku TBA düzeyi olarak hesaplandı. Histopatolojik değerlendirmede doku örneklerinde nekroz alanları ve PMNL akümülasyonu değerlendirildi. Nekroz ve PMNL akümülasyonu 1'den 3'e kadar skorlandırılarak sonuçlar istatistiksel olarak karşılaştırıldı (Tablo 1) [29]. Verilerin analizi SPSS 11.5 paket programında yapıldı. Nekroz ve PMNL skorları ortanca (minimum-maksimum) şeklinde gösterilirken, MDA düzeyleri ortalama±standart sapma biçiminde gösterildi. Gruplar arasında nekroz ve PMNL skorları yönünden farkın anlamlılığı Mann-Whitney U testi ile incelenirken, MDA yönünden farklılıklar Student's t testi ile değerlendirildi. P<0.05 için sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Sonuçlar
Bu çalışma esnasında denekler arasında ölüm olmadı. Fleplerde oluşan nekroz alan boyutu göz önüne alındığında; kontrol grubunda ortalama nekroz alanı boyutu 3.91±1.38 cm2 iken, glukan grubunda ortalama 1.13±0.88 cm2 olarak saptandı. Kontrol grubu ile glukan grubu karşılaştırıldığında sonuç istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0.001). Flepler histopatolojik olarak değerlendirildiğinde; kontrol grubuna ait flep doku örneği mikroskopisinde; yaygın nekroz alanları, yer yer ödematöz dokular ve PMNL izlendi. Glukan grubuna ait flep doku örneği mikroskopisinde ise yaygın PMNL izlendi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında glukan grubunda nekroz ve ödematöz alanlar yok denecek kadar azdı. Nekroz alanları gözönüne alındığında; 2. cm'den alınan doku örneklerinde kontrol grubunda ortanca skor 3 iken (minimum 1, maksimum 3) glukan grubunda ortanca skor 1 idi (minimum 0, maksimum 2). 2. cm'den alınan doku örneklerinde sonuçlar istatistiksel olarak karşılaştırıldığında gruplar arasında anlamlı farklılık vardı (p<0.01). 5. cm'den alınan doku örneklerinde kontrol grubunda ortanca skor 0 iken (minimum 0, maksimum 3) glukan grubunda ortanca skor 0 idi (minimum 0, maksimum 1). 5. cm'den alınan doku örneklerinde sonuçlar istatistiksel olarak karşılaştırıldığında gruplar arasında anlamlı farklılık yoktu (p=0.329). PMNL aktivasyonu gözönüne alındığında; 2. cm den alınan doku örneklerinde kontrol grubunda ortanca skor 1 iken (minimum 1, maksimum 3) glukan grubunda ortanca skor 3'tü (minimum 1, maksimum 3). 2. cm'den alınan doku örneklerinde sonuçlar istatistiksel olarak karşılaştırıldığında gruplar arasında anlamlı farklılık vardı (p<0.04). 5. cm'den alınan doku örneklerinde kontrol grubunda ortanca skor 2 iken (minimum 0, maksimum 3) glukan grubunda ortanca skor 2'ydi (minimum 0, maksimum 3). 5 cm'den alınan doku örneklerinde sonuçlar istatistiksel olarak karşılaştırıldığında gruplar arasında anlamlı farklılık yoktu (p=0.891). Fleplerden alınan doku örnekleri iskemi göstergesi olan MDA açısından değerlendirildiğinde; 2. cm'den alınan doku örneklerinde MDA değeri kontrol grubunda ortalama 2.5±1.13 nmol/g doku iken, glukan grubunda ortalama 0.9±0.56 nmol/g doku idi. 2. cm'den alınan doku örneklerinde kontrol grubu ile glukan grubu karşılaştırıldığında sonuçlar istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0.02). 5. cm'den alınan doku örneklerinde MDA değeri kontrol grubunda ortalama 2.7±2.19 nmol/g doku iken, glukan grubunda ortalama 1.2±1.07 nmol/g doku idi. 5. cm'den alınan doku örneklerinde kontrol grubu ile glukan grubu karşılaştırıldığında sonuçlarda istatistiksel olarak anlamlı farklılık yoktu (p=0.123).
Tartışma
Fleplerde görülen iskemi flep cerrahisinde önemli sorunlardan birisidir. Özellikle distal iskemik nekroz pediküllü deri flep cerrahisinde en sık görülen komplikasyondur. Random iskemik deri flebinde nekroza venöz dönüş eksikliği, iskemi ve oksijen eksikliği neden olmaktadır. Çeşitli çalışmalarla β-Glukanın antibakteriyal, antifungal, antiviral, antitümöral, antienflamatuar etkileri ve makrofaj aktivasyonuna etkileri belirlenmiştir [9,13]. Flep sağkalımını artırmaya yönelik etkili bir farmakolojik tedavi geliştirmek için birçok araştırma ve çalışma yapılmış, günümüzde de bu çalışmalar devam etmekte olmasına rağmen şu an için uygulanan ideal bir farmakolojik tedavi yoktur. β-Glukan belirlenmiş etkileri ile iskemik pediküllü deri fleplerinde sağ kalımı arttırmaya yönelik araştırmalara yardımcı olabilir. Yaptığımız bu çalışmada; doku örneklerini 2. ve 5. cm'lerden aldık. Çalışmamızdan önce yapılan kontrol çalışmalarımızda kontrol grubunun flebinde 2.3 cm ile 5.4 cm'ler arasında nekroz alanları gelişmişti. Biz de glukanın etkisini efektif değerlendirebileceğimiz alan olarak 2. ve 5. cm'leri uygun gördük. İkinci cm'den alınan doku örneklerinde nekroz alanları açısından farklılık olmasını glukanın yara iyileşmesinde anjiogenezisi (neovaskülarizasyon) artırmasının sonucu olarak değerlendirdik. Bilindiği gibi makrofajlar yara iyileşmesinde anahtar hücrelerdir [30]. Ürettiği hümoral faktörlerle yaralanma bölgesindeki hücreleri dinamik olarak kontrol ettiği gösterilmiştir. Sonuçta fibroplazi, fibrogenezis ve anjiogenezisde artış olur. Ayrıca makrofajların yaranın metabolik enerji durumunun kontrolünde yeri vardır [31]. Glukanın makrofaj uyaranı olduğu bilinmektedir [32]. Topikal ve intravenöz preparatların kutanöz yara iyileşmesinde kullanımı ile yara gerilmesinde kayda değer artışlar saptanmış ve bulguları yayınlanmıştır [31]. Histopatolojik açıdan PMNL aktivasyonu iki grup arasında karşılaştırıldığında; 2. cm'den alınan doku örneklerinde PMNL aktivasyonu açısından farklılık olmasını glukanın nötrofil migrasyonunu protein sinyal transdüksiyon arayolları aracılığıyla aktive etmesinin sonucu olarak değerlendirdik [33]. Beşinci santimetreden alınan doku örneklerinde nekroz alanları ve PMNL aktivasyonu açısından gruplar arasında (kontrol grubunda maksimum skor 3, glukan grubunda maksimum skor 1 olmasına rağmen) anlamlı farklılık olmamasını; flebin vasküler beslenmesinin 5. cm'de normal olmasına bağladık. Glukanın iskemik deri fleplerindeki olumlu etkisini literatür çalışmalarında açıklanan mekanizmalarla oluşturduğu düşünülmektedir. Makrofajlar üzerinde glukan için var olan reseptörler tanımlanmıştır [34]. Glukan bu reseptörlere bağlanarak makrofaj fonksiyonlarını düzenler. Glukanın fibroblastlar üzerinde de reseptörleri olduğu saptanmıştır [26]. Glukanın yara iyileşmesinde, fibroblastlardan kollajen biyosentezinin oluşmasını sağlayan yara büyüme faktörlerinin makrofajlarca salınmasını modüle ediyor olabilir [26]. Yüksek derecede saflaştırılmış glukanın, fibroblast, NF-1 (nükleer faktör-1) nükleer bağlanma aktivitesini, prokollajen gen ekspresyonunu ve kollajen biyosentezini uyardığı gösterilmiştir [26]. Araştırmalar glukanın hem Tip I hem de Tip III kollajenin gen ve protein ekspresyonunu zaman ve doz bağımlı olarak uyardığını göstermektedir [26]. Portera ve ark. [21] da tam kat deri yaralarında glukan ile kollajen artışını rapor etmişlerdir. Bu çalışmadan elde ettiğimiz veriler β-Glukan tedavisinin flep nekrozuna karşı önemli bir koruyucu ajan olabileceğini göstermektedir. Ayrıca β-Glukan'ın flep nekrozunu ve lipid peroksidasyonunu da azalttığı görülmüştür. Bu çalışmada elde edilen düşük MDA değerleri fleplerde lipid peroksidasyonunun azaltıldığını göstermektedir. β-Glukan iskemik deri flepleri üzerine açıklanan mekanizmaların bir veya birkaçı ile olumlu etkiye sahiptir.
Sonuç
Bu çalışmamızın sonucunda; iskemi oluşturulmuş tam kat deri fleplerinde iskeminin β-Glukan ile önlenebilir olabileceğini saptadık. β-Glukan, yan etki spektrumunun düşük olması, peroral uygulanabilmesi avantajı ile iskemik deri fleplerinde kullanılabilirliği yönünden olumlu sinyaller vermekle birlikte, insanlarda riski yüksek fleplerde kullanılabilirliği için oldukça geniş araştırmalara gereksinim vardır.
